不同的处理方法制取姜汁对生姜蛋白酶的影响

温东，魏旋，徐保明，*

（1.蒙牛乳业（集团）股份有限公司，河北唐山064000；2.湖北工业大学化学与环境工程学院，湖北武汉430068）

不同的处理方法制取姜汁对生姜蛋白酶的影响

温东1，魏旋2，徐保明2，*

（1.蒙牛乳业（集团）股份有限公司，河北唐山064000；2.湖北工业大学化学与环境工程学院，湖北武汉430068）

以新鲜的老生姜为原料，采用闪式提取法、重力压榨提取法和超声波辅助重力压榨提取法榨取姜汁，测定姜汁中蛋白酶的活力，确定超声波辅助重力压榨提取法为最优方法。并确定超声波辅助处理时料液质量比为1∶3，超声处理时间为15 min，超声功率为250 W。

生姜；生姜蛋白酶；酶活力

Abstract：The old fresh ginger as the raw material,using flash-type extraction method,squeezing gravityassisted extraction and ultrasonic extraction method to extract ginger juice to measure the protease activity in ginger,Ultrasound-assisted gravity to determine the best method.And determine the ultrasonic-assisted processing parameter:material to liquid weight ratio is 1∶3,ultrasonic processing time is 15 min,ultrasonic power is 250 W.

Key words:ginger;ginger protease;enzyme activity

姜是重要的药食两用物质，其中含有多种有用成分，如生姜多糖、姜精油、姜油树脂、生姜蛋白酶等。生姜撞奶又称生姜凝乳，是我国传统的乳制品之一，具有悠久的历史，起源于我国广东省南海县平洲和番禺县沙湾。张平平等[1]用姜汁、生姜蛋白酶粗提物和挥发油分别进行了凝乳试验，得到姜汁中起凝乳作用的物质是生姜蛋白酶。

生姜蛋白酶是从生姜根茎中提取的一种酶，它是蛋白水解酶之一，是一种巯基蛋白水解酶类，具有蛋白酶和胶原蛋白酶双重性质[2]。有研究表明生姜蛋白酶的分子量大约30000 u左右，通过DEAE-纤维素层析柱对该酶进行纯化，证明该酶是由两个组分组成，最适pH为6.5~7.0，巯基化合物为激活剂，等电点分别为7.0和8.0，并鉴定这两种酶均为糖蛋白，证实糖肽型均为非O-型，纯化酶的结晶为六面体[3]。提取生姜蛋白酶首先要得到姜汁，姜汁的制备方法对生姜蛋白酶的活力和提取率有很大的影响。本试验旨在研究不同的处理方法制取姜汁对生姜蛋白酶活性的影响。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

生姜：购于市场；牛血清白蛋白：上海泊奥生物科技有限公司；L-酪氨酸、酪蛋白：国药集团化学试剂有限公司；盐酸：天津市德恩化学试剂有限公司；NaCl：中国尧舜进出口有限公司；考马思亮蓝G-250：上海化学试剂采购供应站进口分装；三氯乙酸：天津巴斯夫化工有限公司；蒸馏水：自制。

Spectrumlab 755s紫外可见分光光度计：上海棱光技术有限公司；FA-N/JA-N电子天平：上海民桥精密科学仪器有限公司；数显恒温水浴锅：城西晓阳电子仪器厂；JHBE-50A闪式提取器：北京金鼎科技发展有限公司；超声波药品处理机：济宁金百特电子有限责任公司。

1.2 分析方法

1.2.1 考马思亮蓝G-250法测定生姜蛋白酶提取率[4]

以牛血清白蛋白为标准品，用0.15mol/LNaCl溶解并配置不同浓度的牛血清白蛋白标准品溶液，分别加入1 mL不同浓度的牛血清白蛋白标准品溶液和5 mL考马思亮蓝G-250溶液于比色管中。以加入1 mL 100 μg/mL牛血清白蛋白溶液和5 mL考马思亮蓝G-250溶液的比色管作为空白样。用紫外分光光度计于595nm下测定各比色管内溶液的吸光度。以标准溶液浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，结果见图1。

图1 蛋白质含量测定标准曲线Fig.1 Standard curve of protein concentration

取适量的不同方法制备得到的姜汁溶液和5 mL考马思亮蓝G-250溶液于比色管中，用紫外分光光度计于595 nm下测定吸光度，所得吸光度要保证在标准曲线线性范围之内。根据标曲将吸光度转换为生姜蛋白酶的量再按式（1）计算生姜蛋白酶在生姜中的含量：

式中：Y为生姜蛋白酶的提取率，%；A为反应物吸光度在酶含量标准曲线上对应的酶溶液浓度，（μg/mL）；B 为姜汁总量，mL；C 为所用生姜的重量，μg；N为姜汁稀释倍数。

1.2.2 酪蛋白消化法测定生姜蛋白酶活力[5]

以L-酪氨酸为标准品，用0.1 mol/L HCl溶液溶解并配置不同浓度的L-酪氨酸标准品溶液，分别取10mL不同浓度的L-酪氨酸标准品溶液，以0.1 mol/L HCl溶液作为空白样，用紫外分光光度计于275 nm下测定各溶液的吸光度。以标准溶液浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，结果见图2。

图2 酶活力测定标准曲线Fig.2 Standard curve of enzyme activity

分别精密量取不同方法制备得到的姜汁溶液适量，激活剂溶液1 mL，40℃水浴预热10 min，加入已预热至40℃的酪蛋白溶液5 mL，摇匀，立即置入40℃水浴中，开始计时。恒温水浴中振荡反应后精密加入55%AcCl3溶液5 mL终止反应，混匀，离心取上清液。以0.1 mol/L HCl溶液作为空白样，用紫外分光光度计于275 nm下测定各溶液的吸光度。根据标曲将吸光度转换为L-酪氨酸的浓度，再按式（2）计算生姜蛋白酶活力：

式中：U为生姜蛋白酶活力；A为根据标曲将吸光度转换为L-酪氨酸的浓度，（μg/mL）；N为姜汁稀释倍数；t为反应时间，h。

按式（3）计算生姜蛋白酶比酶活力P；

式中：P 为姜蛋白酶比酶活力，（U/μg）；C为蛋白酶质量，μg。

1.3 试验方法

取相同质量的新鲜老姜3份，洗净、切片，加入适量纯水，分别采用闪式提取法、重力压榨提取法和超声波辅助重力压榨提取法提取姜汁。改变超声波助提取时的料液比(质量比)、超声时间和超声功率，进行单因素试验，将不同方法得到的姜汁按1.2所述分析方法进行测定。

2 结果与分析

2.1 不同提取方法对姜汁中蛋白酶的影响

闪式提取法、重力压榨提取法和超声波辅助重力压榨提取法对姜汁中蛋白酶的影响见表1。

表1 不同提取方法对姜汁中蛋白酶的影响Table 1 The influence of ginger protease with different extraction methods

根据表1可以看出闪式提取法的蛋白酶提取率最高，其次为超声波辅助重力压榨提取法，但酶活力最高的是重力压榨提取法，其次为超声波辅助重力压榨提取法。这可能是因为闪式提取法可将细胞完全打破，这样更利于生姜蛋白酶的提取，但生姜蛋白酶是一种敏感性物质，温度过高、剪切力过大都可能造成蛋白酶的失活，而闪式提取设备粉碎浆的高速旋转都会造成温度过高、剪切力过大，从而造成蛋白酶的活力降低。超声波辅助重力压榨提取法中超声波的独特的机械振动和空化作用伴随着强大的冲击波和微声流，破坏细胞壁结构，使蛋白酶更易提出而不破坏生姜蛋白酶的活力。综上所述，选用超声波辅助重力压榨提取法有利于得到高活性的生姜蛋白酶，并提高了生姜蛋白酶的提取率。

2.2 不同料液比对姜汁中蛋白酶的影响

采用超声波辅助重力压榨提取法，用不同的料液比（质量比）进行试验，结果见表2。

表2 不同料液比（质量比）对姜汁中蛋白酶的影响Table 2 The influence of ginger protease with different solidliquid ratio（weight ratio）

根据表2可以看出料液比（质量比）对蛋白酶的提取率有影响，随着加水量的增加提取率也随之增加，对酶的活力影响不大。这可能是因为生姜蛋白酶的提取过程是以扩散传质为基础，用适当的水将生姜中的蛋白酶由固相转移至液相，得到含生姜蛋白酶的提取液，是一个固液提取过程。水量增加，料液之间的浓度差增大，有利于传质过程的进行，从而提高生姜蛋白酶的提取率。但当加水量过大时，溶液中生姜蛋白酶的浓度会过低，会造成后续浓缩工作的负担。

2.3 不同超声时间对姜汁中蛋白酶的影响

采用超声波辅助重力压榨提取法，用不同的超声时间进行试验，结果见表3。

表3 不同超声时间对姜汁中蛋白酶的影响Table 3 The influence of ginger protease with different ultrasonic time

根据表3可知，超声处理时间延长有利于生姜蛋白酶的提取，但生姜蛋白酶的活力随超声处理时间的延长先增加后下降。这可能是因为生姜蛋白酶是热敏性物质，延长超声处理时间会造成局部温度过高，从而破坏了生姜蛋白酶的活性。

3.4 不同超声功率对姜汁中蛋白酶的影响

采用超声波辅助重力压榨提取法，用不同的超声功率进行试验，结果见表4。

表4 不同超声功率对姜汁中蛋白酶的影响Table 4 The influence of ginger protease with different ultrasonic powe

根据表4可知超声功率增加有利于生姜蛋白酶的提取，但随着超声功率的增加生姜蛋白酶的活力先增加，当功率高于250 W后，蛋白酶的活力开始下降。这可能是因为生姜蛋白酶对热敏感，超声功率过高会造成局部温度过高，从而使生姜蛋白酶失活。

4 结论

1）温度和剪切力都会对生姜蛋白酶的活力产生影响，选用超声波辅助重力压榨提取法有利于得到高活性的生姜蛋白酶，并提高了生姜蛋白酶的提取率。提取率为0.933%，活力为190 U。

2）采用超声波辅助重力压榨提取法，料液比为1∶3时，有利于蛋白酶的提取，且不会对后续的浓缩工作造成负担。提取率为0.935%，活力为190 U。

3）采用超声波辅助重力压榨提取法，超声处理时间为15 min时，有利于生姜蛋白酶的提取，且不会破坏蛋白酶的活性。提取率为0.897%，活力为190 U。

4）采用超声波辅助重力压榨提取法，超声功率为250 W时，有利于生姜蛋白酶的提取，且不会因局部温度过高而影响蛋白酶的活力。提取率为0.911%，活力为192 U。

[1]张平平,黄雪松,刘宪华.姜汁凝乳的研究[J].中国乳品工业,1999,27(5):17-19

[2]曾剑超.姜汁凝乳机理的探讨[D].西华大学,20084:8-9

[3]代景泉.生姜蛋白酶的分离纯化及其部分特性的研究[D].山东农业大学,2002(5):5-7

[4]韩雅珊.食品化学实验指导[M].北京:中国农业大学出版社,1992:57-62

[5]周惠,鲁治斌,齐杰,等.蛋白水解酶活力测定新方法[J].生物化学杂志,1994,10(5):630-632

The Influence of Ginger Protease with Different Ways Extract Liquid from Ginger

WEN Dong1,WEI Xuan2,XU Bao-ming2,*
（1.Mengniu Dairy(Group)Co.,Ltd.,Tangshan 064000，Hebei,China；2.School of Chemical and Environmental Engineering,Hubei University of Technology,Wuhan 430068，Hubei,China）

2010-02-01

温东（1979—），男（汉），硕士，研究方向：食品加工工艺。

*通信作者：徐保明（1966—），男，高级工程师，副教授。