双酶法水解β-乳球蛋白

史瑜婷,王志耕,方玉明,王玲琴,陈美姣

1(安徽农业大学茶与食品科技学院安徽省乳品工程技术研究中心,安徽合肥,230036)

2(安徽康尔美油脂有限公司,安徽六安,237200)

双酶法水解β-乳球蛋白

史瑜婷1,王志耕1,方玉明2,王玲琴1,陈美姣1

1(安徽农业大学茶与食品科技学院安徽省乳品工程技术研究中心,安徽合肥,230036)

2(安徽康尔美油脂有限公司,安徽六安,237200)

研究了碱性蛋白酶分别与木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶组合对β-乳球蛋白进行双酶解,以水解度(DH)和可溶性氮含量(TCA-SN)表征其反应程度,确定碱性蛋白酶与木瓜蛋白酶为最佳酶解组合。通过正交实验,确定其组合最佳反应条件为:β-乳球蛋白先径酶活添加量为5310 U/g的碱性蛋白酶水解150 min后,再经酶活加量为4500 U/g的木瓜蛋白酶水解,反应到180 min时,水解度可达36.21%。

β-乳球蛋白,双酶水解,水解度

牛乳是婴幼儿的主要母乳替代食品,但牛乳蛋白与母乳蛋白组成上有明显差异。β-乳球蛋白(β-lactoglobulin,β-Lg)是反刍动物乳中的主要乳清蛋白成分,这种蛋白在人乳中不存在,并且是一种重要的过敏原[1-2]。目前,β-乳球蛋白改性技术主要有热处理、糖基化作用、乳酸发酵、高压处理、酶解处理、基因方法和脂肪酸结合等[3]。其中,酶解法具有工艺简单、成本较低等优点[4]。采用蛋白酶对β-乳球蛋白进行适度酶解可以提高其利用率及生物价,也能在一定程度上避免婴幼儿的不良反应。对生产高母乳化、低过敏性的婴幼儿配方乳粉具有重要意义。

由于β-乳球蛋白耐酸、耐蛋白酶水解,单酶对其的水解能力有限,水解度不高,所以双酶水解可在较短时间内获得较高水解度,生成相对分子量较小的多肽 。Ena[5]用Corolase 7092T M(一种Aspergillus属产生的肽酶)、胃蛋白酶和Corolase PPT M(胰腺酶的混合物)单独或分步组合对乳清蛋白进行水解。Pintado等[6]选用胰蛋白酶和胃蛋白酶单独或组合进行水解。但是,现有研究的各种不同的酶解模式所得结果差异较大,不同种类酶对最终水解结果的影响也缺乏系统研究。

本试验以β-乳球蛋白为材料,选用常见蛋白酶中具有突出酶解效果的碱性蛋白酶为第一联合水解酶,再从3种蛋白酶来源(植物蛋白酶、微生物蛋白酶和动物蛋白酶)中分别选择一种通常运用较多的蛋白酶,即木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶为第2联合水解酶[7],进行双酶组合水解试验。由于不同的水解酶具有不同的酶活,根据有关报道中单酶水解蛋白的研究为参考,分别选取3种第2联合水解酶不同的的酶活添加量。因此通过探讨第2联合水解酶的添加时间、添加量以及酶解终止时间对最终水解度(DH)和三氯乙酸可溶性氮质量浓度(TCA-SN)的影响,从中选出最佳双酶组合,并通过正交试验进一步优化水解过程的工艺参数。

1 材料与方法

1.1 材料

β-乳球蛋白(自制,纯度>90%)[8];碱性蛋白酶(68571 U/g):南宁庞博生物工程有限公司;木瓜蛋白酶(51895 U/g):生工生物工程(上海)有限公司;中性蛋白酶(34459 U/g):美国Solarbio公司;胃蛋白酶(61340 U/g):生工生物工程(上海)有限公司;其余试剂均为国产分析纯。

1.2 主要仪器

BS 224 S电子天平:北京赛多利斯仪器系统有限公司;TU-1901双光束紫外可见分光光度计:北京普析通用仪器有限责任公司;PHS-3B精密pH计:上海精密科学仪器有限公司雷磁仪厂。

1.3 方法

1.3.1 测定指标及方法

酶活力测定采用福林-法QB/T 1803-1993[9];氮含量的测定:凯氏定氮法(GB/T14489.2-1993);水解度(DH)的测定:甲醛滴定法[10]。

可溶性氮(TCA-SN)测定:将酶解液与质量浓度为200 g/L的三氯乙酸以1∶1比例混合,4500 r/min离心5 min后取上清液用福林-酚法测定[11]。

1.3.2 酶解单元操作

参照郑海等[12]的研究结果,配制质量浓度为50g/L的β-乳球蛋白溶液,根据碱性蛋白酶的最适反应条件,调节反应条件为48℃、pH 8.5,然后按照E∶S为5310 U(每克蛋白质中)添加碱性蛋白酶,进行一定时间的酶解后,根据第2联合水解酶的反应条件重新调节反应条件,并依据所用酶的活力准确量取第2种蛋白酶加入水解反应器中,继续进行酶解反应,反应到预定时间,迅速升温到90℃,加热10 min灭酶。整个酶解过程中控制酶解液温度(±0.5℃)pH值(±0.1)。

1.3.3 水解条件的初步确定

利用单因素试验,以DH及TCA-SN为指标,酶解单元操作参见1.3.2,对水解条件进行初步确定

1.3.3.1 最适添加时间的确定

分别在碱性蛋白酶反应60、90、120、150、180 min后加入第2联合水解酶,确定最适的添加时间。

1.3.3.2 最适酶活添加量的确定

分别选择3种第2联合水解酶的5个酶活添加量水平,依次为木瓜蛋白酶1000、2000、3000、4000、5000 U/g;中性蛋白酶6000、7000、8000、9000、10000 U/g;胃蛋白酶4000、5000、6000、7000、8000 U/g,确定第2联合水解酶的酶活添加量。

1.3.3.3 最适水解时间的确定

分别在第2联合水解酶反应60、90、120、150、180 min后终止反应,确定最适水解时间。

1.3.4 酶解条件的优化

研究3种双酶组合水解β-乳球蛋白溶液的DH和TCA-SN的变化趋势和差异,从3个双酶组合中确定一个最优组合,再依据该组合单因素试验初步确定的酶解条件,选择添加时间(A)、酶活添加量(B)、水解时间值(C)作为试验因素,以DH为指标,采用正交试验设计,对水解条件进行优化,因素水平见表1。酶解过程同单元操作1.3.2。

表1 正交试验因素水平表

2 结果与分析

2.1 三种双酶组合水解的结果

2.1.1 添加时间对酶解的影响

3组双酶组合的第2联合水解酶添加时间对DH的影响参见图1。

图1 添加时间对DH的影响

由图1可以看出,选择不同的时间点添加第2种反应用酶对最终水解度有明显影响。木瓜蛋白酶组合在碱性蛋白酶反应150min时添加最适,中性蛋白酶组合与胃蛋白酶组合的最适添加时间都是120 min。3个组合中,木瓜蛋白酶组合的酶解效果最好。

由于三氯乙酸能够沉淀所有的蛋白质和长肽,并且其可溶性部分的肽组成不超过4个氨基酸残基,因此TCA-SN的多少能够很好地反映出蛋白酶分解蛋白质成为小肽的能力。3组双酶组合水解β-乳球蛋白TCA-SN的比较结果参见图2。

图2 添加时间对TCA-SN的影响

由图2知,木瓜蛋白酶组合的最适添加时间为150 min,添加时间对胃蛋白酶组合的 T CA-SN影响不大,中性蛋白酶组合在120 min添加最适。3个组合中,中性蛋白酶组合的效果次于其他2组。

2.1.2 酶活添加量对酶解的影响

3组双酶组合的第2联合水解酶酶活添加量对DH的影响参见图3。

由图3知,3种酶组合随着第2种酶活添加量的升高,水解度也在增大。木瓜蛋白酶在添加量为4000 U/g后,水解度不再发生明显变化,中性蛋白酶和胃蛋白酶的添加量分别高于6000、8000 U/g后,水解度反而发生小幅降低,预计是因为添加过量,蛋白酶未能与水解底物反应,但却提高了反应液中蛋白的含量。3个组合中,木瓜蛋白酶组合的效果明显好于其他2组,其最佳酶活添加量为4000 U/g。

图3 酶活添加量对DH的影响

3组双酶组合的第二联合水解酶的不同酶活添加量对TCA-SN的影响结果比较参见图4。

图4 酶用量对TCA-SN的影响

由图4 可以看出,木瓜蛋白酶的最适添加量为4000 U/g,中性蛋白酶的最适添加量为9000 U/g,胃蛋白酶的最适添加量为 7000 U/g。胃蛋白酶组合的效果最优,木瓜蛋白酶组合与之接近,中性蛋白酶组合的效果明显差于其他2组。

2.1.3 水解时间对酶解的影响

3组双酶组合的第2联合水解酶水解时间对DH的影响参见图5。

图5 水解时间对酶解的影响

由图5可以看出,DH会随着水解时间的延长而增加,但水解进行到一定时间后,DH增加平缓。木瓜蛋白酶组合的最适水解时间为150 min,中性蛋白酶组合的为120 min,胃蛋白酶组合的为150 min。3个组合中木瓜蛋白酶组合水解效果最好,最佳水解终止时间为150 min。

3组双酶组合的第2联合水解酶水解时间对TCA-SN的影响参见图6。

图6 水解时间对TCA-SN的影响

由图6知,木瓜蛋白酶组合的最适水解时间为180 min,中性蛋白酶组合的为150 min,胃蛋白酶组合的三氯乙酸可溶性氮含量在水解 90 min后达到较高值,其后变化不明显。3个组合中,胃蛋白酶组合效果最好,木瓜蛋白酶组合的效果与之接近。

2.2 正交试验结果分析

经过上述试验比较可知木瓜蛋白酶组合的DH明显高于其他2组,在TCA-SN方面效果也较好。因此,最后选用碱性蛋白酶与木瓜蛋白酶组合进行正交试验分析。正交试验结果与方差分析见表2、表3。

表2 正交试验结果表

由表2可知,影响水解度各因素的主次关系为B>A>C,其最佳组合为B2A2C3,即:添加时间为150min,酶活添加量为4500 U/g,最终水解时间为180 min。在此条件下DH达到36.21%。方差分析结果表明(表3),酶活添加量极显著地影响水解度(P<0.01)。

表3 正交试验方差分析表

3 结论

(1)选用碱性蛋白酶分别于木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶组合,对β-乳球蛋白进行双酶水解,在研究了第2种酶添加时间、酶活添加量以及水解时间对最终水解度及三氯乙酸可溶性氮质量浓度的影响后,通过比较得出,碱性蛋白酶与木瓜蛋白酶组合的水解效果最优。

(2)通过碱性蛋白酶与木瓜蛋白酶双酶组合水解的正交试验研究表明:酶活添加量为 5310 U/g的碱性蛋白酶先水解150 min后,再加入酶活添加量为4500 U/g的木瓜蛋白酶,反应到180 min时,水解度可达36.21%。本试验主要对β-乳球蛋白双酶水解的研究,还没有对水解产物的风味与应用等作为研究的内容,因此对水解产物的进一步研究是今后值得深入研究的课题。

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ABSTRACTAlkaline protease was combined individually with papain,neutral protease,pepsin to hydrolyzedβlactoglobulin.Degree of hydrolysis(DH)and TCA-SN was indexed to indicate reaction degree.The results showed that the best combination is alkaline protease with papain.The opt imum parameters of the dual-enzyme hydrolysis were:Firstly,alkaline protease was hydrolyzed for 150min where enzyme amount of alkaline protease 5310U/g;then added papain where enzyme amount papain was4500U/g till 180min,and the hydrolysis degree reached 36.21%.

Key wordsβ-lactoglobulin,dual-enzyme hydrolysis,degree of hydrolysis

Study on Dual-enzyme Hydrolysisβ-Lactoglobulin

Shi Yu-ting1,Wang Zhi-geng1,FangYu-ming2,Wang Ling-qin1,ChenMei-jiao1
1(College of Tea and Food Science and Technology ofAnhuiAgriculturalUniversity,Anhui Engineering Technology Research Center,Hefei 230036,China)
2(Anhui KangermeiLimited Company,Liuan 237200,China)

硕士研究生(王志耕教授为通讯作者)。

2009-11-18,改回日期:2010-02-25