鸭疫里默氏杆菌的分离、鉴定及培养条件优化

马志伟，刘世超，许家荣，许俊才

(南京农业大学 动物医学院，江苏 南京 210000)

鸭疫里默氏杆菌病，又称为鸭疫综合征、鸭败血症、鸭传染性浆膜炎和鸭疫巴氏杆菌感染，是由鸭疫里默氏杆菌 (Riemerella anatipestifer，RA)引起的鸭、鹅、火鸡等多种禽类的一种急性或慢性败血性传染病［1］，是目前对世界各国养鸭业造成危害最为严重的传染病之一，给养鸭业带来严重的经济损失。该病最早由Riemer于1904年报道发生在鹅群中;1932年，美国学者 Hendrikson和 Hibert报道在纽约长岛的鸭场中发现;在我国，1975年邝荣禄等首次报道该病在广州存在。1982年郭玉璞等从北京郊区鸭场首次分离到RA以来，河南、福建、四川等地均相继报道了RA感染，近年来该病依然普遍流行［2］。

RA主要感染1～8周龄鸭，尤其是2～3周龄雏鸭，此外也感染鹅和鸡等禽类，其流行无明显的季节性。一年四季均可发生，冬季和春季发病相对较多，夏季相对较少。本病的发生和饲养管理条件等因素有关，主要通过污染的饲料、饮水、飞沫、尘土等经呼吸道和损伤的皮肤，尤其是脚蹼受伤等途径以水平方式传播，低温阴雨、潮湿、寒冷的环境易诱发本病的发生，如饲养密度过大、通风不良、卫生条件差、转舍时受寒冷或雨淋的刺激等均可引起该病暴发流行，加剧该病的发生和病鸭死亡［3］。该病的发病率可达90%以上，死亡率一般在5%～75%之间。迄今为止，国际上共报道RA有 21 个血清型 (1 ～21 型)［4-7］。

2009年4月江苏省南京市郊区某种鸭场15日龄的樱桃谷小鸭爆发疑似鸭疫里默氏杆菌病的疫情，全场90%小鸭发病，死亡率达45%，损失严重。我们对该病进行了较为系统的研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料来源

从发病鸭中选择具有典型临床症状、剖检具有典型心包炎、肝周炎等鸭疫里默氏杆菌病典型症状的病鸭。

1.1.2 培养基

普通营养琼脂平板、麦康凯平板、血琼脂平板、胰酶大豆琼脂平板 (TSA)、胰酶大豆培养基(TSB)。

1.1.3 试剂

革兰氏染液、瑞氏染液;微量生化发酵管;初生牛血清;鸭疫里默氏杆菌1、2型阳性血清 (浙江省农业科学院韦强研究员惠赠)。

1.1.4 试验动物

从养鸭场选购未免疫健康雏鸭，品种:樱桃谷鸭。

1.2 方法

1.2.1 细菌分离培养

无菌采取患病雏鸭的心血、肝脏、气囊、脑等组织及渗出物，分别划线接种于普通营养琼脂平板、TSA平板、麦康凯平板、血琼脂平板上，置37℃ 5%CO2培养箱中培养36 h。再将典型疑似菌落进一步划线接种于TSA平板上，进一步做纯化培养。

1.2.2 菌落形态观察

将分离到的细菌挑取单个菌落划线接种于血琼脂平板和TSA平板上，观察菌落形态。

1.2.3 染色镜检

按常规方法对典型疑似菌落进行革兰氏染色和瑞士染色，镜检。

1.2.4 生理生化试验

无菌钩取分离细菌纯培养物少许，接种于微量生化发酵管中，分别做麦芽糖、果糖、棉子糖、木糖、侧金盏花醇、山梨醇、甘露醇发酵利用试验、吲哚试验、枸橼酸盐利用试验、产硫化氢试验、脲酶试验、硝酸盐还原试验、苯丙氨酸脱氨酶试验、氨基酸脱羧酶试验、MR试验、VP试验、明胶液化试验。

1.2.5 血清学鉴定

挑取平板上的单个菌落接种于TSA培养平板，置37℃培养36 h，按常规方法做玻片凝集试验。用兔抗鸭疫里默氏杆菌1、2型阳性血清进行鉴定，有凝集现象的为阳性，以无菌生理盐水作对照。

1.2.6 PCR鉴定

引物设计与合成。根据GenBank中已发表的所有16S rRNA的基因序列，找到RA 16S rRNA的高度保守区，设计一对特异性引物:上游引物为5′-GAGACACGGACCAGACTCCTACG-3′，下 游 引 物为 5′-ACCTCACGGCACGAGCTGACGACA-3′; 由 上海英骏生物公司合成，扩增长度为749 bp。

PCR反应体系及程序。以细菌的纯培养物为模板，利用设计好的引物进行PCR扩增。

PCR反应体系 (25 μL):菌液 1 μL，上下游引物 (10 μmol)各 1 μL，2 × Mix 12.5 μL，H2O 9.5 μL。

PCR程序:94℃ 4 min;进入循环94℃ 45 s，50℃ 45 s，72℃ 1 min，循环30次;72℃ 7 min;4℃保存。

PCR产物鉴定。电泳鉴定:将 PCR产物以1%琼脂糖凝胶电泳 (含GoldView)，并用凝胶成像系统观察是否出现目的条带，并拍照记录。

测序鉴定:将PCR产物回收纯化后送上海英骏生物公司测序鉴定。

1.2.7 培养条件和培养时间优化

将鉴定为阳性的细菌划线接种于血琼脂平板，37℃培养36 h，挑取单菌落接种于TSB培养基中，振荡 (100 r·min－1，下同)培养24 h，分别吸取5 mL菌液接种于4个装有250 mL TSB培养基的1 L三角瓶中，在A、B、C、D 4种条件下培养:A为培养基中加2%初生牛血清，37℃振荡培养，B为培养基中加2%初生牛血清，37℃静置培养，C为37℃振荡培养，D为37℃静置培养。

培养每隔一段时间后，无菌条件下分别取少许菌液测D600值。记录数据结果，并以时间为横坐标，D600为纵坐标，制作D600-T曲线。

1.2.8 动物回归试验

将鉴定为阳性并经分离纯化的细菌，接种于TSB培养基，37℃振荡培养24 h。用生理盐水洗涤菌体，并稀释至D600约为0.5。

将购自养殖场的10日龄健康雏鸭饲养2日使其适应环境，然后随机分组:对照组2只和试验组4只，分别称重。试验组颈部皮下注射接种0.5 mL菌液，对照组以同样方法注射0.5 mL无菌生理盐水。试验组与对照组分开饲养，连续饲养、观察1周，记录鸭子的食用饲料重量、临床表现等情况;对病死鸭进行病理剖检观察，记录数据。

2 结果与分析

2.1 细菌分离培养

共分离到2株细菌:A和B，在麦康凯平板和普通营养琼脂平板上不生长，在血琼脂平板和TSA平板上可见露珠样小菌落。

2.2 菌落形态观察

血琼脂平板和TSA平板上菌落大小及形态无明显差异，2株细菌的菌落均呈露珠状，圆形隆起，表面光滑，边缘整齐，直径为1～2 mm，颜色为灰白色，较透明;与RA菌落的形状相似，疑似为RA。

2.3 染色镜检

革兰氏染色后，镜检可见革兰氏阴 (－)性小杆菌，少数呈椭圆形;瑞士染色后，镜检可见小杆状细菌菌体呈两极浓染，多为单个分散排列，少数成双或短链排列。

2.4 生理生化试验

生理生化试验结果见表1。

表1 生理生化试验结果

生理生化试验结果与RA相符合，因此，初步认定2株细菌均为鸭疫里默氏杆菌，但仍有待进一步确认。

2.5 血清学鉴定

玻片凝集试验结果见表2。

表2 玻片凝集试验结果

由凝集试验结果可以确定，A、B 2株细菌均为鸭疫里默氏杆菌，且血清型相同，均为1型。

2.6 PCR鉴定

2.6.1 电泳鉴定

PCR产物电泳结果见图1。

图1 PCR产物电泳鉴定结果

由图1可见，1、2型鸭疫里默氏杆菌均能扩增出目标片段，大小与预期一致。

2.6.2 测序鉴定

2株细菌的序列完全相同，且与所选基因片段序列一致性为100%。因此，可确认这2株细菌为鸭疫里默氏杆菌。

2.6.3 构建系统发生树

通过 NCBI网站的 BLAST程序搜索与该16S rRNA基因序列相似度较高的其它菌株的序列，通过ClustalX和Mega程序，将PCR产物序列与其它7株细菌 (RA strain RAf103、Riemerellasp.IPDH 359/90、Uncultured bacterium clone nbw546c05c1、Flavobacteriumsp. 130704W2、 UnculturedCryomorphaceaebacterium clone XZXXH203、Anaerophaga thermohalophilastrain Fru22、Pasteuria goettingianae)的相似序列进行比对，构建系统发生树，如图2。

图2 1型RA与其它7株细菌构建的系统发生树

由图2可以推断，试验室所分离到的细菌与RA strain RAf103相同，与 Riemerella sp.IPDH 359/90同属，与Flavobacterium sp.130704W2同为黄杆菌科，因此可以判定该株细菌为RA。综上所述，该株细菌为1型鸭疫里默氏杆菌。

2.7 培养条件和培养时间优化

RA为兼性厌氧菌，其对培养条件的要求较为苛刻，生长速度较慢，不易被分离到，因此需选择合适的培养条件和时间［9］。为了更加了解RA的生长特性，获得较佳的培养条件和时间，本试验对RA的培养条件和培养时间进行了研究和分析，结果见图3。

图3 RA菌在4种培养条件下的生长情况

由图3中数据可见，A(37℃振荡，加2%初生牛血清)、B(37℃静置，加2%初生牛血清)、C(37℃振荡)、D(37℃静置)4种培养条件下，RA的生长情况为A条件下速度最快，C条件下其次，B和D条件下的速度较慢;且振荡培养比向培养基中加入2%初生牛血清对RA生长的促进作用更加明显，因此，在培养RA时，应尽可能振荡培养。

从图3可以看出，在A和C(均37℃振荡培养)2种培养条件下，RA的生长在28～32 h从对数期进入稳定期;而在B和D(均37℃静置培养)培养条件下，RA的生长没有出现明显地从对数期向稳定期的转变。因此，RA在振荡条件下培养28 h，即可完成培养，节省培养时间，若培养时间过长，RA进入稳定期，则会影响RA的生长。

2.8 动物回归试验

动物回归试验结果见表3。

在饲养过程中，对照组鸭长势良好，育肥迅速，平均每日增重50 g，肉料较高，相对节约了饲料消耗，增加了养鸭场的经济效益，2只鸭均无患病临床症状;剖解后未见任何病变，心脏、肝脏等器官均正常，且未分离到RA。

注:CK为注射生理盐水;RA为注射1型RA;Δ体重为1周内雏鸭体重变化;Δ饲料为1组雏鸭1周内消耗饲料重量;肉料比为1周内雏鸭体重变化与所消耗饲料的比值;死亡数为1周内死亡鸭的数量。

试验组鸭生长速度则大大降低，平均每日增重不到20 g，且肉料较低，使饲养的经济效益降低;试验组鸭均出现严重程度不同的鸭疫里默氏杆菌病的典型临床症状:精神沉郁、萎顿，头颤动，羽毛粗乱无光泽，食欲下降，肢体无力，行动困难，伏卧不起，排绿色稀粪等。剖解病死鸭发现各内脏器官出现不同程度的病变，心脏明显较小，心包膜增厚，肠系膜增多，将内脏器官包住，肝脏较小，并见心包膜、肠系膜、肝脏外膜周围出现灰白色纤维素性渗出物。从病死鸭心血、肝均分离到RA，经玻片凝集和染色试验，证明其血清型与攻毒菌相同。

3 小结

鸭疫里默氏杆菌可以使鸭、鹅、火鸡等多种禽类患病，导致家禽育肥减慢或死亡，严重影响了养鸭业等的经济效益，给农业造成巨大的经济损失。

本次研究从养鸭场分离到2株细菌，通过传统生理生化和分子生物学2种方法对其进行了鉴定，构建了系统发生树，充分证明了这2株细菌为1型鸭疫里默氏杆菌。相对传统方法，分子生物学方法具有快速、高效、准确的优点，本文建立的针对RA的16S rRNA基因PCR技术可用于快速检测、鉴定鸭疫里默氏杆菌。

鸭疫里默氏杆菌对培养基的营养要求较高，在普通营养琼脂平板上不生长，为了更好地了解RA的生长特性，本次试验对RA的生长条件和生长时间进行了研究。试验结果表明，RA在37℃振荡培养能够较好地生长，提高培养基的营养则能够进一步促进RA的生长，但效果没有振荡培养的明显，因此在分离和培养 RA时，应尽可能振荡培养。

我们还进行了动物回归试验。RA的感染使雏鸭生长速度减慢1/2以上，发育不良，并使1只试验组鸭病死，严重影响了养鸭业的经济效益。与这2株RA的来源养鸭场相比，试验室动物回归试验的雏鸭病死率相对较低，分析原因可能是饲养环境的问题:在大多数情况下，动物患病并不是由仅仅一种病原的侵染，可能是由于多种病原同时侵染或者病原侵染时动物的饲养环境较差，如低温阴雨、潮湿、寒冷等恶劣环境的刺激，使得动物发病严重，造成病死率很高;而试验室的饲养条件相对较好，从而导致动物回归试验的病死率并不高。所以，加强饲养管理，减少不良环境因素造成的应激反应，乃是动物生产的基本策略。

［1］吕敏娜，黄承锋，张毓金.鸭疫里默氏杆菌大肠杆菌二联蜂胶苗的研制［J］.中国兽医杂志，2005，41(1):48－50.

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［3］胡清海，张知良，苗晋锋，等.江苏安徽两省鸭疫里默氏杆菌病的流行病学调查研究［J］.中国兽医科技，2001，31(8):12－13.

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［6］Pathanasophon P，Sawada T，Tanticharoenyos T.New serotypes of Riemerella anatipestifer isolated from ducks in Thailand［J］.Avian Pathol，1995，24:195－199.

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