褐藻胶寡糖激发子活性研究

刘中华,张 杰,郭 婕

褐藻胶寡糖激发子活性研究

刘中华,张 杰,郭 婕

(周口师范学院生命科学系,河南周口466000)

寡糖可作为激发子诱导植物产生抗性反应,提高防御酶活力,积累植保素,从而增强自身的抵抗力.本实验利用细菌AGN12的胞外酶对褐藻胶进行生物降解,得到不同聚合度的寡糖样品.实验结果表明,褐藻胶寡糖能激活大豆子叶的防卫系统,诱导合成和积累较多的植保素,并且对大豆子叶防御酶有良好的诱导作用.

褐藻胶寡糖;激发子活性;大豆子叶;植保素;苯丙氨酸解氨酶

尽管化学农药在农业生产中发挥了巨大作用,但频繁而不加区分地随意施用已引发严重的生态环境污染和药物残留等危害人类健康的问题[1].某些寡糖具有激发子活性,在植物抗病生理过程中能够诱导植物产生植保素和防卫响应因子,抵御外来微生物的侵染[2].首先被发现具有激发子活性的是来自于病原菌 Phytophthora sojae细胞壁碎片中的寡糖,能够诱导植物合成植保素,抵御植物病原菌的侵染[3].因此,寡糖作为化学农药的替代品,具有对人类和生态环境无害、不易产生抗药性、可生物降解等优点,已成为生物农药的发展方向.褐藻胶降解菌AGN12能够分泌褐藻胶裂解酶,通过β -消去反应裂解褐藻胶,并在非还原末端产生C4,5不饱和双键[4],这种带有不饱和双键的褐藻胶寡糖具有激发子活性,诱导植物的自我防御响应[5-6].本文利用细菌A GN12分泌的褐藻胶裂解酶对褐藻胶进行生物降解,检测了不同降解程度的褐藻胶寡糖的激发子活性,旨在为进一步研究开发新型生物农药奠定基础.

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 菌种

褐藻胶降解菌AGN12,由腐烂海带中分离得到.

1.1.2 大豆子叶

市售新鲜大豆经水培得到.

1.1.3 培养基

固体培养基:海藻酸钠7 g,(NH4)2SO43 g, NaCl 5 g,三种无机盐溶液(5%K2HPO4,2.5% MgSO4,7%KNO3)各10 mL,琼脂18 g,去离子水1000 mL,p H 7.0.

种子培养基:海藻酸钠7 g,(NH4)2SO43 g, NaCl 5 g,三种无机盐溶液(5%K2HPO4,2.5% MgSO4,7%KNO3)各10 mL,去离子水1000 mL, p H 7.0.

发酵培养基:同种子培养基.

1.2 实验方法

1.2.1 粗酶液制备

将对数生长期的AGN12的种子培养液以3%接种量接入液体培养基,30℃摇床培养24 h后,将发酵液在4℃,10 000 r/min离心10 min,取上清液作为粗酶液.

1.2.2 褐藻胶寡糖的制备

将p H 7.0的0.03 g/mL的褐藻胶溶液于30℃水浴中预热10 min后,与粗酶液按体积比5∶1混合,在30℃水浴中催化褐藻胶降解反应.每隔30 min取样一次,沸水浴中加热20 min终止反应后,作为褐藻胶寡糖样品,并分别测定其粘度、还原糖浓度和总糖浓度.还原糖浓度采用3,5-二硝基水杨酸法测定[7].总糖浓度采用苯酚-硫酸比色法测定[7].粘度测定采用毛细管自然沉降法测定,取一支0.1 mL的移液管吸取待测样品至满刻度,记录溶液下降 0.05 mL所需要的时间,并以时间“秒”为粘度计量单位.

1.2.3 褐藻胶寡糖激发子活性的测定

1.2.3.1 植保素测定

大豆子叶法[8]:取长势相同的大豆子叶,用无菌蒸馏水冲洗干净,再用滤纸吸干.在无菌条件下,用刀片削去子叶下表皮,形成厚约1 mm,长度约6 mm的伤口,去离子水浸泡清洗约30 s后,取出,用滤纸吸干水分,放置在铺有滤纸的培养皿中,每个培养皿中放10片子叶作为一个处理.分别用0.02 mL褐藻胶寡糖样品处理每片子叶伤口后,在25℃黑暗条件下培养24 h,然后将每组子叶转移到盛有10 mL去离子水的三角瓶中振荡30 s,测定OD286,以此来表示大豆植保素的相对含量.

1.2.3.2 苯丙氨酸解氨酶活性测定

按大豆子叶法对大豆子叶作划伤处理,分别取0.02 mL褐藻胶寡糖样品处理每片子叶伤口后,在25℃黑暗条件下培养,每隔一段时间取样一次.将约2 g(10片)的大豆子叶,置于含有0.6 mL甘油,1.2 mL,7 mmol/L L-半胱氨酸和4.2 mL,50 mmol/L Tris-HCl(p H 8.8)缓冲提取液中,冰浴研磨,于4℃下10 000 r/min离心10 min,上清液即是粗酶液.取0.1 mL粗酶液,与0.2 mL 100 mmol/L苯丙氨酸溶液混合,37℃水浴保温 30 min,用0.1 mol/L的三氯乙酸0.4 mL终止反应,加3 mL水后,测定OD290.以0.1 mL提取液代替0.1 mL粗酶液,按上述反应条件与苯丙氨酸溶液反应,所得的溶液作为空白.苯丙氨酸解氨酶的活力单位定义为:上述反应条件下,在30 min内生成的肉桂酸使OD290增加0.01个单位所需要的酶量为一个活力单位.

2 结果与讨论

2.1 褐藻胶寡糖样品的特征

褐藻胶降解酶催化褐藻胶降解,每隔30 min取样一次,测定反应液的黏度、还原糖浓度和总糖浓度,并通过总糖与还原糖的比值计算褐藻胶水解物的表观聚合度,结果如表1所示.

表1 寡糖样品的特性

由表1可以看出,在褐藻胶降解过程中,反应液黏度随时间延长而降低,在最初的几小时黏度下降的较快,最后黏度基本保持不变.还原糖浓度随时间延长而增加,但还原糖达到最大值时的时间滞后于粘度降到最低的时间.平均聚合度随时间的延长逐渐降低,最后基本保持不变.

2.2 褐藻胶寡糖激发子活性

2.2.1 植保素

所制备的寡糖是否具有激发子活性可以通过多种生物学方法进行检测,其中最传统的方法是测定大豆子叶中植保素的积累.并非所有的寡糖都能激发植物细胞产生自我防御响应,寡糖的激发子活性一般与其聚合度有关[1],聚合度太小的寡糖不能诱导植物产生防卫反应,而聚合度太大的寡糖由于细胞壁的屏障作用无法与细胞膜接触,因此,只有特定长度的寡糖才具有激发子活性.因此本文将表1中不同聚合度的寡糖样品分别进行测定,结果如图1所示.

由图1可知,不同的褐藻胶寡糖样品诱导植保素的生成能力不同,褐藻胶寡糖的激发子活性与聚合度有关,最初生成的寡糖样品不具有诱导能力,而样品S4、S5和S7能够诱导生成较高浓度的植保素,说明它们具有较好的激发子活性.其中寡糖样品S7所诱导生成的植保素含量最高,说明寡糖样品S7在大豆子叶中具有最强的激发子活性,此时的表观聚合度为6.8.

图1 褐藻胶寡糖诱导植保素的积累

2.2. 苯丙氨酸解氨酶

苯丙氨酸解氨酶(PAL)是普遍存在于高等植物中的一种酶.植物次生代谢产物类黄酮植保素和木质素的生物合成都必须通过苯丙烷类代谢途径, PAL酶是植物苯丙烷类代谢途径中的限速酶,因此PAL酶活性也被作为测定激发子活性的重要生理指标.根据大豆子叶法测定结果,选取激发子活性最强的寡糖样品S7作为实验材料,进一步研究褐藻胶寡糖对大豆子叶防御酶的激活作用.

图2 褐藻胶寡糖对PAL酶活性的诱导

由图2可知,经寡糖样品S7处理后,大豆子叶中PAL酶活性均明显高于对照,说明褐藻胶寡糖能诱导PAL酶活性,其活性变化趋势与对照组的变化一致,经S7处理后的大豆子叶中PAL酶最大活性比处理前高36%,比对照组高19%.

3 结论

褐藻胶寡糖具有激发子活性,能够诱导植物细胞合成植保素.表观聚合度为6.8的褐藻胶寡糖具有最强的激发子活性,且该寡糖在诱导大豆子叶防御系统方面可起到与病原菌类似的作用,使植物体PAL活力提高,从而提高植株的抗病性.

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Elicitor-activity of oligosaccharide produced from alginate

LIU Zhonghua,ZHANG jie,GUO jie
(Department of Life Science,Zhoukou Normal University,Zhoukou 466000,China)

Oligosacchride could induce the phytoalexin to make plant respond to phytopathogenic attack.It was found that alginate could be degraded to oligosaccharide by strain AGN12.In this paper,oligosaccharide samples with different degree of polymerization were prepared by degrading alginate with strain AGN12.The results indicated that alginate-oligosaccharide could induce the phytoalexin in soybean cotyledon and elimite defense response enzymes.

alginooligosaccharides;elicitor-activity;soybean cotyledon;phytoalexin;PAL

Q81

A

1671-9476(2010)05-0082-03

2010-02-17;

2010-05-11

周口师范学院青年科研基金资助项目(No.ZKNUQN200916)

刘中华(1982-),女,河南周口人,讲师,硕士,主要从事食品与发酵工程的教学与研究工作.