工程菌β-胡萝卜素累积及提取条件优化的研究

冯亦平，李 珍，王健梅

（1.山西农业大学，山西太谷030801；2.长治职业技术学院园艺系，山西长治046000）

类胡萝卜素（carotenoids）是一类呈现黄色、橙色或红色的植物色素，广泛存在于各种动植物和微生物中。许多类胡萝卜素是VA的重要来源，同时又是强抗氧化剂，具有一定的防癌功效[1～3]。其中，β-胡萝卜素是类胡萝卜素家族中的典型代表。它的分子式为C40H56，分子质量为536.85[4]，易溶于二硫化碳（0.02 g/mL）、沸腾乙醚（0.33 g/L）、正己烷（0.07 g/L），溶于氯仿和苯，微溶于乙醇和甲醇，不溶于水，无毒[5]。β-胡萝卜素是一种比较昂贵的天然色素[6]，是目前国际市场上颇受欢迎的产品，具有广阔的市场前景。

传统提取β-胡萝卜素的方法是将新鲜胡萝卜绞汁以后，倒入高压均质机中均质，然后加入沉淀剂CaCl2·2H2O和稳定剂氨水/乙醇，离心，弃上清液，得到橙红色沉淀[7]；然后将沉淀冷冻干燥，得到粉末状干燥沉淀，并在沉淀中加入有机溶剂石油醚萃取β-胡萝卜素[8]，之后旋转蒸发浓缩，回收有机溶剂后得到β-胡萝卜素油状物。但是该法产量低，不易操作。噬夏孢欧文氏菌（Erwinia uredovora）是种植物病原菌，可合成番茄红素、β-胡萝卜素、玉米黄素、玉米黄素二糖苷等多种类胡萝卜素，其合成途径最早被Masaki等阐明[9]，且参与代谢的多个相关酶的编码基因也被克隆。李丽[10]研究了无机盐和碳氮源对噬夏孢欧文氏菌中类胡萝卜素积累的影响，确定了该菌累积类胡萝卜素的最佳培养条件；刘敏等[11]也将噬夏孢欧文氏菌的crtE，crtB，crtI及crtY基因置于T7启动子的控制之下，构建了2个重组质粒，两重组质粒共转化大肠杆菌，获得了累积β-胡萝卜素的工程菌。

本试验总结了国内外学者的试验方法和经验，使β-胡萝卜素于原核生物（E coli DH5α）中进行表达，优化β-胡萝卜素累积及提取方法，使其表达量和提取量达到最佳，旨在解决人们对它与日俱增的需求问题。

1 材料和方法

1.1 菌种

菌株（E coli DH5α，含 pACCAR16△crtX），由山西农业大学生命科学学院实验室保存。

1.2 方法

挑取大肠杆菌工程菌单菌落，接种于5 mL LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。取2 mL菌液加入100 mL培养基中，扩大培养约3～4 h。然后将菌液分成若干份，保存于4℃冰箱中待用。将培养好的菌液分别编号并加入诱导剂IPTG，放入摇床进行诱导，取出后3 000 r/min离心收集菌体。称重加入4 mol/L的HCl水浴破壁，然后直接加入丙酮进行抽提，4 000 r/min离心15 min（上清液于4℃暗处保存），沉淀用少量丙酮再抽提2次，合并3次的上清液，加入1 mL氯仿，3 000 r/min离心8 min，弃上清液，最后测定下层液体的OD值。

2 结果与分析

2.1 诱导时间对工程菌累积β-胡萝卜素的影响

取培养好的5份菌液分别编号，并加入等量的诱导剂IPTG使其终浓度为0.5 mmol/L，放入摇床，分别诱导 1.25，2.25，3.25，4.25 h，按 1.2 提取方法进行β-胡萝卜素的提取，再用分光光度计对以上样品测定其在446，475，508 nm波长下的吸光度值，同时以不加IPTG的菌液作为对照。

从表1可以看出，随着诱导时间的延长，样品在不同波长时的吸光度值总体上呈先增加后减少的趋势，即β-胡萝卜素的积累量先增加后减少，诱导时间为1.25 h时，3种波长下所得到的OD值均为最大，其平均值分别是2.25 h的6倍和3.25 h的2倍，即在IPTG诱导1.25 h时，工程菌的β-胡萝卜素积累量达最大。这是因为随着诱导时间的增加，细菌密度增大，生活活力降低，甚至死亡，致使β-胡萝卜素不能合成进而积累；而诱导2.25 h时，β-胡萝卜素积累量最少，与对照（不加诱导剂IPTG）相当，这可能是由于在试验过程中光照、温度等因素使其降解所致。综上所述，IPTG诱导1.25 h时，最有利于β-胡萝卜素的积累。

表1 不同诱导时间下样品在波长446，475，508 nm时的吸光度值

2.2 不同浓度诱导剂IPTG在相同诱导时间下对工程菌积累β-胡萝卜素的影响

取培养好的5份菌液分别编号，并加入IPTG 使 其 终 浓 度 分 别 为 0.2，0.5，0.8，1.0，2.0 mmol/L，诱导1.25 h后取出，按1.2方法提取β-胡萝卜素，并用分光光度计对以上样品进行吸光度值的测定。

从表2可以看出，随着IPTG终浓度的增加，样品在不同波长下的吸光度值呈先增加后减少的趋势，即β-胡萝卜素的积累量呈现出先增加后减少的趋势（OD值先增加后减少）；IPTG终浓度为0.8 mmol/L时，所得氯仿抽提液的OD值达最大，也就是说，此时工程菌的β-胡萝卜素积累量达最大。这说明低浓度IPTG诱导可促进β-胡萝卜素的大量、高效积累，而高浓度的IPTG可能对细胞具有一定的毒害作用，致使工程菌死亡，无法大量表达目的产物β-胡萝卜素。因此可以得出，工程菌在0.8 mmol/LIPTG诱导下，最有利于β-胡萝卜素的积累。

表2 不同诱导剂IPTG量的样品在波长446，475，508 nm下的吸光度值

2.3 菌液不同OD值对工程菌积累β-胡萝卜素的影响

由于IPTG高效启动重组菌外源基因的表达时需要消耗能量，而菌体本身的生长也需要吸收能源物质，二者之间存在一定的竞争作用，这就要求把握好IPTG诱导的时机。

表3显示，随着菌液OD600值的增加，样品在不同波长下的吸光度值总体上呈先增加后减少的趋势，即β-胡萝卜素的积累量整体上呈现出先增加后减少的趋势，当菌液OD600值为0.6时，所得到的氯仿抽提液的OD值达最大，即此时工程菌的β-胡萝卜素积累量达最大。这可能是由于菌液OD600值较低时，工程菌可能正处于迟缓期，此时加入IPTG，结果会导致菌体的生长繁殖大受影响；而菌液OD600值较高时，工程菌处于稳定期或衰亡期，有害代谢产物积聚，细菌繁殖开始变慢，死亡数增加，不利于β-胡萝卜素积累。综上所述，OD600值为0.6的菌液最适合β-胡萝卜素的积累。

表3 不同OD值的菌液经实验后样品在446，475，508 nm的吸光度值

2.4 盐酸量对β-胡萝卜素提取量的影响

把收集到的β-胡萝卜素按1.2试验方法提取（其中，HCl和丙酮分别按 5，10，15，20 mL/g（湿菌体）加入），并用紫外分光光度计法测定其中的β-胡萝卜素含量（表4）。

表4 盐酸量对β-胡萝卜素提取量的影响

由表4可知，随着HCl量的增加，最后测得的OD值即β-胡萝卜素的提取量也逐渐增大。当HCl量为2.6 mL时，β-胡萝卜素的提取量达到最大，再增大HCl量会使β-胡萝卜素的提取量逐渐降低。因此，HCl量为2.6 mL即15 mL/g（湿菌体）时，最后测得的OD值最大，即β-胡萝卜素提取效果最好。

2.5 HCl处理时间对β-胡萝卜素提取量的影响

把收集的β-胡萝卜素按1.2试验方法提取 （HCl处理时间为 10，20，30，40，50，60 min，HCl破壁温度为35℃，丙酮抽提时间为1.5 h），用紫外分光光度计法测其中的β-胡萝卜素含量。

由表5可知，随HCl处理时间的逐渐延长，最后测得的OD值即β-胡萝卜素提取量也逐渐增大。当HCl处理时间为40min时，β-胡萝卜素提取量达到最大；继续延长破壁时间到60 min，β-胡萝卜素提取量反而降低。因此，HCl处理时间为40 min时，β-胡萝卜素提取效果最好。

表5 HCl处理时间对β-胡萝卜素提取量的影响

2.6 HCl破壁温度对β-胡萝卜素提取量的影响

把收集的β-胡萝卜素按1.2试验方法提取（HCl破壁温度为 30，35，40，45，50，55 ℃，HCl处理时间为20 min，丙酮抽提时间为1.5 h），用紫外分光光度计法测其中的β-胡萝卜素含量。

由表6可知，随着HCl破壁温度的逐渐升高，最后测得的OD值即β-胡萝卜素的提取量也逐渐增大，当HCl破壁温度为40℃时，β-胡萝卜素的提取量达到最大；再升高温度可能会使β-胡萝卜素受热分解，从而致使提取量逐渐降低。因此，HCl处理温度为40℃时，最后测得的OD值最大，即β-胡萝卜素提取效果最好。

2.7 丙酮量对β-胡萝卜素提取量的影响

把收集的β-胡萝卜素按1.2试验方法提取（其中，HCl和丙酮分别按 10，20，30，40 mL/g（湿菌体）加入），用紫外分光光度计法测其中的β-胡萝卜素含量。

由表7可知，随着丙酮量的增加，最后测得的OD值即β-胡萝卜素的提取量也逐渐增大，当丙酮量为2.40 mL时，β-胡萝卜素的提取量达到最大，再增大丙酮量则会使β-胡萝卜素的提取量逐渐降低。因此，可以得知丙酮量为2.40mL即20 mL/g（湿菌体）时，最后测得的OD值最大， β-胡萝卜素提取效果最好。

表6 HCl破壁温度对β-胡萝卜素提取量的影响

表7 丙酮量对β-胡萝卜素提取量的影响

2.8 丙酮抽提时间对β-胡萝卜素提取量的影响

把收集的β-胡萝卜素按1.2试验方法提取（其中，丙酮抽提时间为 0.5，1.0，1.5，2.0 h 的时间梯度，HCl处理时间为20 min，HCl破壁温度为35℃），并用紫外分光光度计法测其中的β-胡萝卜素含量。

由表8可知，随着丙酮抽提时间的逐渐延长，最后测得的OD值即β-胡萝卜素的提取量却逐渐较少。在丙酮抽提时间为0.5 h时，β-胡萝卜素的提取量达到最大，而升高温度会使β-胡萝卜素遭受高温破坏，从而致使提取量逐渐降低。因此，可以得知丙酮抽提时间为0.5 h时，最后测得的OD值最大，即β-胡萝卜素的提取效果最好。

表8 丙酮抽提时间对β-胡萝卜素提取量的影响

3 结论与讨论

虽然β-胡萝卜素在很多植物和微生物中均有分布，但由于其所含色素的成分复杂，且很多β-胡萝卜素与天然脂肪酸会形成酯，致使提取单一组分的成本较高。随着β-胡萝卜素合成途径的阐明和相关基因的相继克隆，通过基因工程的办法使原本不产生β-胡萝卜素的生物可大量积累这类色素成为可能。

本试验将在大肠杆菌上表达的β-胡萝卜素用丙酮抽提法提取出来，并使用变量法对传统的提取方法作了改进，试图对提取条件进行优化。试验得出，用大肠杆菌作工程菌积累β-胡萝卜素的最佳条件是：诱导时间1.25 h，IPTG浓度0.8 mmol/L，菌液 OD值 0.6，HCl量 15 mL/g（湿菌体），破壁时间40 min，破壁温度40℃，丙酮量20 mL/g（湿菌体），抽提时间0.5 h。

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