无菌豚鼠与普通豚鼠血液学参数的比较

张琨，孙淑华，仉慧敏，胡小燕，王艳荣，孟金萍，刘云波

(北京协和医学院中国医学科学院实验动物研究所，北京 100021)

研究报告

无菌豚鼠与普通豚鼠血液学参数的比较

张琨，孙淑华，仉慧敏，胡小燕，王艳荣，孟金萍，刘云波

(北京协和医学院中国医学科学院实验动物研究所，北京 100021)

目的对普通级豚鼠进行剖宫产，培育无菌豚鼠模型，并比较无菌豚鼠和普通级豚鼠的血液学参数。方法行子宫摘除术摘除子宫，在无菌隔离器中将子宫剥离取仔，用人工哺乳的方法将仔豚鼠培育成无菌豚鼠，并在固定的周期检测豚鼠的无菌情况。采用全血细胞计数分析仪、全自动血液生化分析仪测定无菌豚鼠、普通豚鼠的血常规和血生化参数。用SPSS12.0进行统计分析。结果无菌豚鼠和普通豚鼠在白细胞(WBC)、嗜碱性粒细胞数(BA#)、单核细胞百分比(MO)、血红蛋白浓度(MCHC)、中性粒细胞数(NE#)、嗜酸性粒细胞数(EO#)、淋巴细胞数(LY#)七个血常规指标上有差异显著性，其他指标没有显著性差异;谷丙转氨酶(ALT)、乳酸脱氢酶(LDH)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、葡萄糖(GLU)、总胆固醇(CHO)、总胆红素(TBIL)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL－C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL－C)、甘油三酯(TG)、球蛋白(GLO)、A/G、K、Na、谷酰转肽酶(GGT)15个指标上差异有显著性，其他指标差异无显著性。结论通过规范的子宫摘除术和人工喂养的方法获得符合标准的无菌豚鼠，与普通豚鼠在多项血液学指标上差异有显著性。

剖宫产手术;无菌豚鼠;血常规;血生化

19世纪末期开始，无菌动物和SPF动物的研究逐步兴起，相继培育出了各种无菌实验动物，1932年Glimstedt成功将无菌豚鼠培育两个月［1］。我所自1980年开始研究无菌豚鼠并培育成功。

目前国内还没有对无菌豚鼠的生物学特性进行系统的观察比较，无菌豚鼠也没有作为实验动物模型在科学研究中进行规模化的应用。本实验对无菌豚鼠的培育进行了规范化研究，并对无菌豚鼠的血液学参数进行测定，为无菌豚鼠的使用和推广提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物:①普通豚鼠一:普通级临产豚鼠，购自北京科宇动物养殖中心【SCXK(京)2007－2003】，自然生产，10只仔鼠，与其母亲合养一周后放入隔离器中饲养。②普通豚鼠二:10只，购自北京科宇实验动物养殖中心【SCXK(京)2007－2003】。③无菌豚鼠:普通级临产豚鼠，购自北京科宇动物养殖中心【SCXK(京)2007－2003】，用CO2气体麻醉后进行子宫摘除术，逐层开腹，暴露子宫，用止血钳夹住子宫颈和两边输卵管，从远离子宫端剪断输卵管和子宫颈，将子宫通过过氧乙酸池传入无菌隔离器中，挤出胎仔，轻轻按摩仔豚鼠使其自主呼吸，1～2h后开始人工喂养，豚鼠出生第2天便可自主进食。获仔鼠10只，在无菌隔离器中人工饲养。

1.1.2 仪器:7020型日立生化分析仪，日本株式会社日立高新技术公司生产。

1.1.3 饲养环境:塑料薄膜隔离器;洁净度百级;压力梯度:塑料薄膜隔离器对外界48 Pa;换气次数每小时56次;环境温度20～25℃;相对湿度40%～65%。

1.2 方法

1.2.1 动物分组:将三种来源的动物分为3组:①第1组:普通级豚鼠，30～40日龄，饲养环境为普通环境，体重220～240 g。②第2组:普通级豚鼠，30～40日龄，饲养环境为隔离环境，体重180～230 g。③第3组:无菌级豚鼠，30～40日龄，饲养环境为隔离环境，体重138～185 g。

1.2.2 血液学指标测定:每只豚鼠心脏采血1.5 m L;0.5 m L EDTA抗凝，立刻测定血常规;1 m L放入普通EP管中，静置1h，3000 r/min离心15 min，取血清，测定血生化。由于无菌豚鼠比较敏感，每次采血前所有组不予禁食。

1.2.3 测定项目与方法

(1)自动生化测定仪:使用前按照仪器使用规程进行自检，仪器各项参数正常后方可进行测定，而且质控标准品数值在正常范围内，测定的数值才能有效。

(2)血生化检测指标及方法:丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、肌酸磷酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)使用连续检测法;高密度脂蛋白胆固醇(HDL－C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL－C)使用清除法;尿素氮(BUN)使用酶偶速率法;肌酐(CRE)使用苦味酸法;尿酸(UA)使用尿酸酶－过氧化物酶法;白蛋白(ALB)使用溴甲酚绿法;总蛋白(TP)使用双缩脲法;总胆固醇(CHO)、甘油三酯(TG)使用酶比色法;葡萄糖使用葡萄糖氧化酶法。

(3)血常规检测指标及方法:白细胞计数(WBC)、红细胞计数(RBC)、红细胞容积(HCT)、血小板计数(PLT)、平均血小板体积(MPV)使用阻抗法;血红蛋白(HGB)使用分光光度计法;平均红细胞容积(MCV)、平均红细胞血红蛋白(MCH)、平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC)使用计算法;白细胞分类使用ACV技术(双聚焦流技术)。

1.2.4 统计学处理:所有数据用SPSS12.0软件进行统计处理，比较豚鼠血液学参数的差异。

2 结果

2.1 无菌豚鼠微生物检测结果

根据中华人民共和国无特定病原体动物、无菌动物生活环境及粪便标本的检验方法GB/T 14926. 41－2001，取无菌豚鼠的新鲜粪便，使用巯基乙醇培养基和马丁培养基分别在37℃和27℃下进行培养，每日观察并记录检测结果，均为阴性。

2.2 无菌豚鼠和普通豚鼠血常规测定结果

无菌豚鼠和普通豚鼠血常规测定结果见表1。用SPSS 12.0软件对两组豚鼠血常规进行独立样本T检验，与普通豚鼠相比，无菌豚鼠在白细胞(WBC)、单核细胞百分比(MO)、淋巴细胞数(LY #)、平均血红蛋白浓度(MCHC)、中性粒细胞数(NE #)、嗜酸性粒细胞数(EO#)、嗜碱性粒细胞数(BA#) 7个指标上差异有显著性(P＜0.05);在红细胞(RBC)、平均红细胞体积(MCV)、平均血红蛋白含量(MCH)、血红蛋白(HGB)、红细胞比容(HCT)、红细胞体积分布宽度(RDW)、平均血小板体积(MPV)、单核细胞百分比(MO)中性粒细胞百分比(NE)、嗜酸性粒细胞百分比(EO)、嗜碱性粒细胞百分比(BA)、单核细胞数(MO#)等参数上差异无显著性(P＞0.05)。

表1 无菌豚鼠、普通豚鼠一血液学常规数值比较Tab.1 Comparison of the values of routine blood test in the germ free and conventional guinea pigs

2.3 无菌豚鼠和普通豚鼠血生化测定结果

无菌豚鼠和普通豚鼠血生化测定结果见表2。用SPSS 12.0软件对3组豚鼠血生化进行单因素方差分析和多个独立样本的F检验，其中乳酸脱氢酶(LDH)、白蛋白(ALB)、葡萄糖(GLU)、尿素氮(BUN)、总胆红素(TBIL)、谷酰转肽酶(GGT)、尿酸(UA)、Ca、P 9个指标指标使用单因素方差分析;谷丙转氨酶(ALT)、磷酸肌酸激酶(CK)、总蛋白(TP)、谷草转氨酶(AST)、总胆固醇(CHO)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL－C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL－C)、甘油三酯(TG)、球蛋白(GLO)9个指标使用多个独立样本的F检验。3组豚鼠在ALT、LDH、TP、ALB、GLU、CHO、TBIL、HDL－C、LDL－C、TG、GLO、A/G、K、Na、GGT 15个指标上差异有显著性(P＜0.05);在CRE、ALP、AST、ALP、Ca、BUN、P、CK、UA等指标上差异无显著性(P＞0.05)。其中无菌豚鼠和普通豚鼠一在LDH、TP、ALB、GGT、Na 5个指标上与普通豚鼠二差异有显著性。两组普通豚鼠在CHO1、TBIL、HDL、LDL、TG 5个指标上与无菌豚鼠差异有显著性。在GLO、A/G、K 3个指标上3组豚鼠差异均有显著性。在GLU上，普通豚鼠一和无菌豚鼠及普通豚鼠二差异无显著性，但是无菌豚鼠和普通豚鼠二差异存在显著性。在ALT指标上普通豚鼠一与另外两组上差异有显著性。

3 讨论

3.1 无菌检测

无菌豚鼠培养过程中的难点是无菌状态的保持，为了确保无菌豚鼠不被空气中的微生物污染，进入隔离器中的任何物品都要进行严格的灭菌处理。饲料经过60Co在50 kGy的水平上辐射灭菌:耐高温的垫料等物品采取121℃40 min进行灭菌。对于不耐高温的塑料器皿等，则用2%的过氧乙酸充分浸泡，以彻底灭菌。另外，还要定期依据GB/T14924.1－2001;GB/T14924.2－2001对无菌豚鼠微生物携带情况进行检测，确保培育出的无菌豚鼠质量。

在评价无菌检测的结果时，检测样品数量与所使用的培养方法有紧密的联系，必须按检测要求严格执行。另外，无菌检测时检测样品数量和检测准确性之间的关系会随着污染率的变化而变化，微生物的污染会在同一个隔离器内的个体之间迅速传播，所以为了提高检测的准确性，必须按一定间隔日期反复进行检测，以保证实验动物无菌状态的维持。

表2 无菌豚鼠、普通级豚鼠一、二血生化的比较Tab.2 Comparison of blood biochemical parameters between the germ free and conventional guinea pigs(groups 1 and 2)

3.2 无菌豚鼠和普通级豚鼠血常规的比较

无菌豚鼠在无菌隔离器中生长，温度、湿度恒定，呼吸经过高效过滤的空气，人工乳和水经过高压灭菌，饲料经过60Co照射，免疫系统没有经受微生物的侵袭，防御功能较低，而白细胞是机体防御系统的一个重要组成部分，所以无菌豚鼠血常规中白细胞值较低;白细胞分类比较中，五种细胞的数量和百分比在两组普通级豚鼠的比较中存在5处差异，均低于普通级豚鼠，这与无菌豚鼠缺乏微生物刺激有关;无菌豚鼠和普通级豚鼠的平均血红蛋白浓度也存在差异。饲养在隔离器中的普通豚鼠虽然体内带菌，但是与无菌豚鼠生活环境的压力、温度、湿度相似，所以并没有出现文献上报道的血红蛋白、血小板、红细胞比容等方面的差异［6］。同时实验中的两组豚鼠与相关文献上报道的普通豚鼠的血生化值作比较发现在WBC、MCV、MCHC、PLT、MPV上均有一定程度的差异，文献中的普通豚鼠与实验中的普通豚鼠在其他指标上无异。这提示温度、压力等环境因素影响动物的血液学参数［16－18］。

3.3 无菌豚鼠和普通级豚鼠血生化的比较

血液中免疫球蛋白是机体受到抗原刺激后由浆细胞合成，它能与外来的特异性抗原起免疫反应保护机体，无菌豚鼠的免疫系统处于休眠状态，没有接受任何菌群的刺激，所以TP、GLO、ALB均低于饲养在普通环境的豚鼠，A/G高于饲养在普通环境的豚鼠。饲养在隔离器中的普通级豚鼠相对于无菌豚鼠和饲养在普通环境的豚鼠蛋白含量低，但是白蛋白的含量高于无菌豚鼠。饲养在隔离器中的普通级豚鼠体内含有菌群，但由于其生活在隔离环境中，体内的微生物菌群体系不完整，所以其体内白蛋白的含量低于饲养在普通环境的普通动物，但是高于无菌动物。无菌豚鼠体内无寄生菌，菌类在脂肪类和糖类物质的代谢方面起了重要的作用。有研究表明，无菌动物体内胆固醇的代谢减慢，在体内难以转化为可供使用的小分子甾醇［15］。所以高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、胆固醇、甘油三脂及糖在3组豚鼠中也存在差异。血清中的LGH、GGT均在肝脏中产生。文献中报道的SPF级动物的肝脏脏器系数较小，免疫功能低下。无菌动物较之SPF级动物免疫功能更低，所以这两项指标均低于普通豚鼠。同时将实验中的普通豚鼠二的指标与文献中报道的正常豚鼠作比较，大部分结果相似，但是有些数据与文献中相差较大，可能与检测方法和单位有关［17－18］。

实验证明，微生物环境因素对实验动物血液学参数的影响十分显著，血液学参数是机体各组织、器官功能和状态的反映，说明寄生微生物对宿主的生理、代谢及机体防御等方面都有显著影响。无菌动物生活在无菌的隔离环境中，没有微生物的影响，无菌动物逐渐适应，其生理生化各方面都有改变，尤其是免疫系统，无菌动物的免疫系统未被激活，这些特征决定了无菌动物有很多普通动物不可替代的应用［14］。如微生物相互作用、人类正常菌群模型和一些感染、免疫模型，对研究一些疾病的病理生理也有着不可替代的作用。但是目前国际上无菌动物的应用还很少，国内更是鲜有人研究。对无菌豚鼠和普通级豚鼠血液学参数进行测定，为无菌动物在我国医学科研中的广泛应用提供重要的基础数据，两组数据的比较也便于医学科技工作者在实验动物模型的选择过程中参阅、参考。

［1］宫川澄.无菌动物［M］.东京:医齿药出版株式会社.1973，114－116.

［3］张岩，王荫槐，王安京，等.无菌豚鼠无菌兔骨髓嗜多染性红细胞微核研究［J］.上海实验动物科学，1990，10(3):137－139.

［4］孙伟，汤球，袁卫，等.清洁级封闭群Hartley白化豚鼠常用生物学数据的测定［J］.中国比较医学杂志，2006，16(9): 566－568.

［5］邹勇，周洪欣，李宝义，等.清洁级豚鼠部分生化与血液学指标测定［J］.上海实验动物科学，1992，12(2):102－103.

［6］Trávnícek J，Mandel L，Trebichavsky I，et al.Immunological state of adult germ free miniature Minnesota pigs［J］.Folia Microb.1989，34(2):157－164.

［7］Backhed F，Ding H，Wang T，et al.The gut microbiota as an environmental factor that regulates fat storage［J］.Proc Nat Acad Sci U S A，2004，101(44):15718－15723.

［8］李增强，孙淑华，孟金萍，等.SPF兔与普通兔血液学参数的比较研究［J］.中国比较医学杂志，2008，18(4):51－55.

［9］Corring T，Juste C，Simoes－Nunes C.Digestive enzymes in the germ－free animal［J］.Reprod Nutr Dev.1981，21(3):355－370.

［10］Newton WM.Environmental impact on laboratory animals［J］. Adv Vet Sci Comp Med.1978，22:1－28.

［11］Coates ME.Gnotobiotic animals in research:their uses and limitations［J］.Lab Anim.1975，9(4):275－282.

［12］Wostmann BS.Nutrition and metabolism of the germ free mammal［J］.World Rev Nutr Diet.1975，22:40－92.

［13］Coates ME，Gnotobiotic animals in nutrition research［J］.Proc Nutr Soc.1973，32(2):53－58.

［14］王荫槐，王钜.悉生动物学［M］.辽宁大学出版社，2007，147－150.

［15］Pollard M.Applications of germ－free animals to problems in comparative medicine［J］.Adv Vet Sci.1967，11:139－157.

［16］顾为望，王洪涛，张嘉宁，等.封闭群FMMU白化豚鼠与短毛三色豚鼠血液成分比较［J］.中国实验动物学报，1997，5 (1):23－28.

［17］丁正梁，舒家模，林至刚，等.豚鼠的临床血液学、生物化学测定值［J］.上海市牧兽医通讯，实验动物科学专辑.1983，3(2):110－115.

［18］邹勇，周洪欣，李宝义.清洁级豚鼠部分生化与血液学指标测定［J］.上海实验动物科学，1992，12(2):102－103.

Com parison of Hem atological Param eters in Germ-Free and Conventional Guinea Pigs

ZHANG Kun，SUN Shu－hua，ZHANG Hui－min，HU Xiao－yan，WANG Yan－rong，MENG Jin－ping，LIU Yun－bo
(Institute of Laboratory Animal Science，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College，Beijing 100021，China)

ObjectiveTo compare the hematological parameters in germ－free and conventional guinea pigs.MethodsGerm－free guinea pigs were obtained by cesarean section，and the offsprings were fed with artificial milk by hand in the germ free isolator.The gem－free situation was detected at fixed time points by hematology analyzer. Hematological parameters of the germ－free and conventional guinea pigs were compared with SPSS 12.0.ResultsThe germ free guinea pigs showed significant differences in the values of WBC，MO，LY#，MCHC，NE#，EO#and BA#of routine blood cell counts(P＜0.05)in comparison with those of the conventional guinea pigs.There were also significant differences in the values of ALT，LDH，TP，ALB，GLU，CHO，TBIL，HDL－C，LDL－C，TG，GLO，A/G，K，GGT，and Na concentrations between the two groups of guinea pigs(P＜0.05).ConlusionA germ－free guinea pig model has been successfully established by normative cesarean section.There are significant differences in a number of hematological parameters between germ－free and conventional guinea pigs.

Cesarean section;Germ free guinea pig;Routine blood test;Blood biochemical parameters

Q－593

A

1005－4847(2010)02－0176－05

2009－12－18

国家重大疾病基金实验动物技术平台(编号:2009ZX10004－402)。

张琨(1985－)，女，在读硕士研究生，研究方向:环境因子生物学效应。E－mail:qiankunkai_8723@163.com

刘云波，研究员。E－mail:liu－yunbo@263.net