自然发情与诱导发情小鼠子宫内膜中雌激素受体α表达的比较

高雅，林自力，张鸿波，梁鸿斌，刘云海，郭勇，倪和民

(北京农学院动物科学技术系，北京 102206)

研究报告

自然发情与诱导发情小鼠子宫内膜中雌激素受体α表达的比较

高雅，林自力，张鸿波，梁鸿斌，刘云海，郭勇，倪和民

(北京农学院动物科学技术系，北京 102206)

目的从雌激素受体α(ERα)的角度探讨自然发情小鼠与诱导发情小鼠的子宫内膜上，雌激素受体α表达是否受内源雌激素的特异诱导而变化，两者之间是否存在差异。方法27只同日龄母鼠，根据处理方式的不同随机分为3个组:自然发情假孕组(对照组)、诱导发情处理假孕组和自然发情假孕第1天摘除卵巢组，3个组的小鼠在见栓后第4、6、8天分别取样后，采用免疫组织化学法观察小鼠子宫内膜中雌激素受体α的表达情况。结果免疫组化结果显示，3个处理组的小鼠子宫内膜上皮细胞核、胞质都有ERα存在，且主要表达在腺上皮;见栓第4、6、8天时，诱导发情处理组小鼠子宫内膜的ERα阳性率均显著高于自然发情组和自然发情第1天摘除卵巢组(P＜0.05);见栓第8天时，自然发情处理组小鼠子宫内膜中的ERα阳性率与自然发情第1天摘除卵巢组差异不显著(P＞0.05)，但见栓第4、6天时两者阳性率差异显著，自然发情处理组小鼠子宫内膜中的ERα阳性率显著高于自然发情第1天摘除卵巢组(P＜0.05)。结论诱导发情处理的小鼠子宫内膜，其表面雌激素受体α表达显著高于自然发情小鼠，且两者都受其内源性雌激素的特异诱导而变化。

小鼠;子宫内膜;雌激素受体α;免疫组织化学

哺乳动物的早期胚胎着床是一个复杂的过程，当胚胎着床时，母体子宫内会分泌一些特殊蛋白以确保顺利着床［1］，着床成功与否与胚胎正常发育、子宫内膜的容受性及适宜的内分泌环境密切相关［2］。雌激素是一种类固醇激素，主要在卵巢中合成，可以导致子宫内膜在形态和生理方面的改变，从而影响子宫的容受性，保证胚胎的顺利着床。一般认为雌激素是通过和细胞内特异性雌激素受体(estrogen receptor，ER)结合，从而引发启动转录等一系列下游事件，产生生理学效应［3］，所以比较子宫内膜上ER的表达变化对探讨改善动物子宫的受容性有重要意义。

目前已知的雌激素受体有两种，分别是ERα和ERβ，表达在不同动物卵巢、睾丸、乳腺、小脑等组织上。通过基因敲除显示:ERα敲除小鼠(αERKO)是高度不育的，这种小鼠的子宫发育不正常，子宫基质组织结构松散且发育不良［4－5］。而ERβ敲除小鼠(βERKO)虽然能生育，但是幼仔个体数目少且体型也较小［6］，说明ERβ对小鼠胚胎着床的影响并不是很大，但可能对着床后的胚胎发育有直接影响。

目前已经有人通过免疫组化的方法研究了不同动物不同组织上两种ER受体分布表达变化的情况，但针对同期发情处理后与自然发情小鼠子宫中ERα和ERβ的相应差异变化研究却未见报道。此外，由于在正常小鼠胚胎着床时子宫中的ERβ受体作用不明显，所以在此不对其进行研究。有鉴于此，本研究拟针对以上实际存在的问题，从ERα的角度探讨同期发情处理后，这些受体在小鼠子宫内膜与自然发情同一时期小鼠的子宫内膜上的分布表达是否存有差异，同时结合分析ERα的相应分布是否受其内源性雌激素的特异诱导，从而为提高体外受精胚胎移植妊娠率提供必要的依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物:本实验选用ICR系小鼠，购自北京维通利华实验动物科技有限公司，动物许可证号为SCXK(京)2002－2003。母鼠为8周龄，体重28 g左右;公鼠8～24周龄，体重35 g左右。

1.1.2 实验试剂:ERα兔单克隆抗体(Epitomics，1115－1);抗兔SABC试剂盒、3，3－二氧基联苯胺(DAB)显色试剂盒(武汉市博士德生物工程公司);磷酸缓冲液(PBS)自配。

1.2 方法

1.2.1 实验动物分组:将27只母鼠随机分为3个组:①自然发情假孕组(对照组):选择阴门淡粉红色的雌性青年鼠按1∶1的比例与成年结扎公鼠合笼过夜交配，次日早8:00检查交配情况。见阴道栓者即可以用于实验并以见栓当日记为妊娠1 d。②同期发情处理假孕组:于实验开始的当天19:00，选择阴门淡粉红色的雌性青年鼠，每只腹腔注射PMSG 10 IU，间隔46 h，于隔天的17∶00腹腔注射人绒毛膜促性腺激素(hCG)每只15 IU。注射hCG后按1∶1的比例与成年结扎公鼠合笼过夜交配，次日早8:00检查交配情况。见阴道栓者即可以用于实验。③自然发情假孕第1天摘除卵巢组:选择阴门淡粉红色的雌性青年鼠按1∶1的比例与成年结扎公鼠合笼过夜交配，次日早8∶00检查交配情况。见阴道栓者于9∶00在麻醉条件下切除双侧卵巢即可用于实验。

1.2.2 样本采集:3个处理组见栓后的小鼠，分别于见栓后第4、6、8天随机各选取3只，处死后取出子宫，生理盐水冲洗，4%的多聚甲醛4℃浸渍固定48～96 h。

1.2.3 免疫组化SABC法操作程序:①常规石蜡包埋、切片;②切片脱蜡至水，3%H2O2室温30 m in以灭活内源性酶PBS冲洗一下;③0.01 mol/L的枸橼酸盐缓冲液进行抗原热修复，PBS洗3次;④5% BSA在37℃作用40 min;⑤一抗兔抗ER多抗(1∶50)4℃过夜，PBS洗3次;⑥生物素化羊抗兔IgG在37℃孵育30 min，PBS洗3次;⑦滴加SABC 37℃30 m in，PBS洗4次;⑧DAB显色5 m in;⑨苏木素复染、脱水、透明、封片、显微镜观察。

阴性对照以0.01 mol/L的PBS液代替⑤中的一抗，其余步骤同上。

1.2.4 图像分析:将子宫内膜细胞按照子宫腺上皮细胞、子宫腔上皮细胞和子宫内膜基质细胞三种细胞类型分别计数:随机选取5张切片，每张切片随机观察5个视野，取5个视野的细胞阳性表达率(阳性细胞/细胞总数)均值。

1.2.5 统计方法:实验数据采用DPS数据处理软件单因素方差，Duncan检验分析，数据相关分析结果采用平均数±标准误(±s)表示。

2 结果与分析

2.1 小鼠子宫内膜中ER表达分布

免疫组化染色阳性切片背景无色或淡蓝色，ER免疫反应物质为黄色或棕黄色;阳性细胞的胞质和胞核中着有黄色或棕黄色反应颗粒，阴性细胞的细胞核被苏木素染成淡蓝色或蓝色。对照组切片染色阴性，背景无色或淡蓝色，无黄色或棕黄色染色，说明免疫组化SABC法具有ER免疫反应的特异性。见图1(封三)，箭头所指为阳性反应物。

2.2 小鼠子宫内膜中ER的阳性率变化

2.2.1 各处理组子宫内膜腺上皮细胞中ERα在见栓第4、6、8天阳性率的变化:见表1。

表1 各处理组子宫内膜腺上皮细胞中ERα在见栓第4、6、8天阳性率的变化(阳性百分比)(±s)Tab.1 The intensity of ERα expression in glandular epithelium(The rate of positive staining)(±s)

表1 各处理组子宫内膜腺上皮细胞中ERα在见栓第4、6、8天阳性率的变化(阳性百分比)(±s)Tab.1 The intensity of ERα expression in glandular epithelium(The rate of positive staining)(±s)

注:上标相同字母表示差异无显著性(P＞0.05)，字母不同表示差异有显著性(P＜0.05)。Note:The same letters indicate non－significant differences among them(P＞0.05).The different letters indicate a significant difference among them(P＜0.05).

组别Group第4天Day 4第6天Day 6第8天Day 8自然发情假孕组Natural estrus pseudocyesis 0.54194±0.0499b0.36280±0.0814b0.44777±0.1317b同期发情处理假孕组Estrus synchronization and pseudocyesis 0.71983±0.0738a0.64532±0.1083a0.77763±0.0407a自然发情假孕第1天摘除卵巢组Natural estrus，pseudocyesis and being ovariectomized at the first day of estrus 0.29302±0.2182c0.22226±0.0761c0.31469±0.1744b

从表1可以看出:同期发情处理假孕组小鼠子宫内膜腺上皮细胞ER阳性率在见栓第4、6、8天均显著高于自然发情组和自然发情假孕第1天摘除卵巢组(P＜0.05)。自然发情假孕第1天摘除卵巢组在见栓的第8天与自然发情假孕组差异无显著性，但第4、6天时则显著低于自然发情组(P＜0.05)。

2.2.2 各处理组子宫内膜腔上皮细胞中ERα在见栓第4、6、8天阳性率的变化:在该实验中，只在自然发情第6天和诱导发情第6天的小鼠子宫内膜腔上皮上检测到ER的表达，其余各组均未检测到ERα的表达。

2.2.3 各处理组子宫内膜腺基质细胞中ERα在见栓第4、6、8天阳性率的变化:在该实验中，未检测到子宫内膜腺基质细胞中有ER的表达。

3 讨论

ER在小鼠子宫内膜中的分布是受雌激素调节的。经典的雌激素作用模式是与雌激素受体结合，通过靶基因上游的雌激素反应元件调控靶基因的转录，这种机制被称为雌激素的基因组作用模式，需要雌激素与ER形成复合体后转移至细胞核才能发挥作用［7］。然而，随着研究的不断深入，也有研究表明除经典的基因组作用模式外，雌激素还存在非基因组作用模式，这种作用模式不需要雌激素进入细胞核，而是通过分布于细胞膜的雌激素结合蛋白，激活细胞内信号级联放大反应［7］。因此，雌激素受体既表达于胞核中，也表达于胞质和细胞膜上。本实验中，在各处理组的细胞质和细胞核中均可检测到ERα，说明ERα通过激活不同的信号途径介导了不同的调控作用。

本实验选择在见栓后的第4、6、8天检测ERα，主要是因为小鼠胚胎着床通常发生在见栓后的第4天，此时小鼠体内的E2分泌会达到一个高峰，通过观察几个不同处理组的小鼠子宫内膜中ER的表达分布情况，从而可以比较几组处理小鼠子宫中ER在胚胎着床前后的表达分布是否存在差异。本实验中设有一自然发情假孕第1天摘除卵巢组，目的在于雌激素主要在卵巢中合成，摘除卵巢后可以观察到小鼠子宫内膜中的ERα是否受到来自卵巢的内源性雌激素的影响。从结果可以看出，自然发情假孕第1天摘除卵巢组小鼠子宫内膜中的ERα阳性率在见栓第4、6天时均显著低于另外两组，且在见栓第8天仍显著低于诱导发情组，这说明不同处理方法的小鼠子宫内膜中ERα在胚胎着床前后的表达存在差异。此外，自然发情假孕第1天摘除卵巢组的小鼠可能是由于摘除卵巢后缺少了内源性雌激素，使得ERα的表达下降，从而可以推测小鼠子宫内膜中ERα的分布受到内源性雌激素的特异诱导而变化。另外，本实验中的诱导发情采用了PMSG +hCG的组合，由于PMSG半衰期较长，在体内不容易及时清除，从而会影响卵泡的发育和及时排卵，继而产生不能排卵的大卵泡，而大卵泡可分泌雌二醇，造成胚胎着床前后一段的时期内外周血液中E2水平较高［8－9］，从而影响子宫内膜中ERα的表达，因此推断可能内源性雌激素对子宫内膜中ER的表达具有上调作用。

本实验中，在各处理组的腺上皮中都检测到了ERα的存在，这说明ERα影响子宫腺体的发育，与前人研究的ERα敲除小鼠的子宫腺体数量少相一致。但是在子宫内膜基质上并没有检测到ERα的存在，这与张翼海［10］及连艳［11］的结果相一致，但与Bruce等的结果不一致，他们在正常女性子宫内膜的基质细胞中也检测到ERα的存在［1］。另外，本实验也只在见栓第6天的自然发情组和同期发情组的小鼠子宫内膜腔上皮检测到ERα，因此推测可能在见栓后不同时期，由于雌激素的影响，ERα通过激活不同定位的信号途径来介导调控作用。

综上所述，同期发情处理和自然发情的小鼠在胚胎着床阶段其子宫内膜上的ERα分布是存有明显差异的，这可能会进一步影响胚胎着床的过程以及胚胎移植的妊娠率。

(本文图1见封三。)

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Com parison of the Expression of Estrogen Receptor α in M ouse Endom etrium between Those Treated by Estrus Synchronization and in Natural Estrus

GAO Ya，LIN Zi－li，ZHANG Hong－bo，LIANG Hong－bin，LIU Yun－hai，GUO Yong，NI He－m in (Department of Animal Science＆Technology，Beijing University of Agriculture，Beijing 102206，China)

ObjectiveTo investigate the distribution of estrogen receptor α(ERα)in the endometrium between the m ice treated by estrus synchronization and in natural estrus，and analyze whether such kind of ERα distribution is solely induced by endogeneous estrogen.M ethods According to the different treatments，total 27 ICR mice were divided into three groups:(1)the group in natural estrus and pseudocyesis(the control group)，(2)the group treated by estrus synchronization and pseudocyesis，(3)the group in natural estrus，pseudocyesis and being ovariectomized at the first day of estrus.ResultsThe results of immunohistochem istry showed that the estrogen receptor α distributed in both nucleus and cytoplasm，and ERα mainly expressed in glandular epithelium(GE).On day 4，6，8，the positive staining cell number in the estrus synchronization group was much higher than those of natural estrus(P＜0.05).On day 8，the positive staining cell number in the group of natural estrus and pseudocyesis and being ovariectomized at the first day of estrus，was not significantly different(P＞0.05)，but on Day 4 and 6，these data of the natural estrus group were significantly higher than those of the pseudocyesis one being ovariectomized at the first day of estrus(P＜0.05).ConlusionThe expression of ERα in mouse uterine endometrium by estrus synchronization is much higher than that of the natural estrus one.The ERαdistribution is mainly induced by their endogeneous estrogen.

Mouse;endometrium;estrogen receptor α;immunohistochemistry

R321－33

A

1005－4847(2010)02－0168－04

2010－02－22

北京市自然基金重点项目“胚胎滋养层干细胞的功能性分析”(项目批准号:5091002)，国家“十一五”“863计划”重点项目“家畜卵泡高效诱导发育技术研究与应用”(项目批准号:2008AA101003)，国家“十一五科技支撑计划”项目“肉羊高效育种关键技术的研究与应用”(项目批准号:2008BADB2B04－4)。

高雅(1984－)，女，北京人，硕士研究生，研究方向:产科及胚胎工程。

倪和民，男，副教授;研究方向:动物产科及胚胎工程E－mail:nihemin@yahoo.com.cn