浅谈猪腺病毒的鉴定

东莞市虎门镇农业技术服务中心 陈颖杰

浅谈猪腺病毒的鉴定

东莞市虎门镇农业技术服务中心 陈颖杰

根据猪腺病毒保守区六邻体基因设计两对简并引物，建立了nested PCR的检测方法，对病猪的气管分泌物作检测，并用其中的阴性病料接种PK-15细胞，做病毒分离，次分离到了猪腺病毒，并进行了鉴定。

猪腺病毒 nested PCR 分离 鉴定

一、引言

腺病毒寄生于人和动物以及禽类的眼、上呼吸道和消化道内，但大多呈隐性或不显性感染。人的腺病毒大多存在于肠道内，但也与感冒、咽炎、急性呼吸道感染和结膜炎等一系列疾病有关。动物中的腺病毒很多，但只少数引起临床症状。猪腺病毒是于1964年在英格兰首次被分离的，此后，通过病毒分离和血清学调查逐步证明猪腺病毒在猪群中广泛存在。本文探讨猪腺病毒的分离和鉴定，将为进一步研究猪腺病毒的生物学特性以及猪腺病毒载体的构建打下基础。

二、分离鉴定试验

1. 试验病料。

对送检的病猪剖检后，用棉拭子取下气管和支气管的分泌物，用PBS洗脱棉拭子，洗下的液体经冻融三次，离心取上清，加入双抗保存备用。

参照GenBank上猪腺病毒的序列，针对猪腺病毒保守的六邻体基因设计两对简并引物，引物由上海生物工程公司合成。

引物序列为：

First lef t GATGTCATGGAYAACGTGAAC

First right CACGGAGGAGTCRAACTGGATG

Nested lef t TACTGCMAGTTYCACATCCATCCACGT

Nested right GGAATGGAGATGGGCAGGTT

2. 试验方案。

本试验方案如图1所示。

图1 试验方案

3. 病毒分离。

待细胞90%长满单层，倒掉生长液，用Hanks液洗1-2次，加入经双抗处理的上清液，加入量为生长液的十分之一。置CO2培养箱培养1.5h，每隔15min摇一次。倒掉上清液，加入维持液，即含2-3%小牛血清的DMEM。继续培养，逐日观察细胞病变。无细胞病变的72h后将细胞反复冻融三次，离心取上清，用nested PCR检测并继续接种细胞，盲传四代不出现细胞病变或用nested PCR检测为阴性的则判为腺病毒分离阴性。

4. 电镜观察。

在上电镜观察之前，必须先将病毒样品浓缩，使悬液内的被检病毒有一定的数量，一般要求106-1010个病毒粒子/ml较好。本材料为游离的病毒粒子，故可用296的磷钨酸染色1min左右。镊子要通过火焰或其他方法彻底清洁，防止污染其他病毒。在观察时要先用较暗的光斑照射1-2 min，再逐渐用强光照射，避免出现支持膜破裂或收缩等现象。

经过负染的病毒在电镜下观察，可见到与病毒图谱中腺病毒的形态结构相似的病毒颗粒。如图2为放大6.9万倍的病毒颗粒，图3为放大4.5万倍的病毒颗粒。

图2 6. 9万倍

图3 4. 5万倍

三、鉴定试验结果

本实验根据猪腺病毒保守区六邻体基因设计两对引物，特异性高，而且应用nested PCR的方法来扩增特异性片段，提高了检测的灵敏度，在一定程度上克服了假阳性的问题。

检测51份病料，只有1份为猪腺病毒阳性，而分离病毒时却能从13份“阴性”病料中分离出10株猪腺病毒，而且为不同的毒株，病毒分离的阳性率达76.9%。这说明猪腺病毒在猪群中的感染是普遍的，nested PCR的方法尽管灵敏度很高，但是它受很多因素的影响，比如在核酸抽提过程中受到人为因素的影响而使核酸丢失或者带有太多的杂蛋白而影响酶的作用。当然，病毒分离也有人为因素的影响，比如接毒时病料的PH值和一价阳离子的浓度都会影响到病毒的吸附，但是这些因素的调节相对于核酸的抽提容易得多。所以，由于人为因素的影响，经nested PCR检测为阴性的病料并不能完全判为阴性，病毒分离才是相对可靠的。

在病毒分离过程中，接毒的每一代细胞经反复冻融三次后，均作nested PCR检测，直到第四代仍为阴性的才判为病毒分离阴性。有十份病料在接毒的第一、二代作nested PCR检测时均为阴性，而到第三代时则为阳性，但不出现细胞病变，其中有四份从第四代到第八代均稳定地出现细胞病变，其余六份传到第八代仍没有出现细胞病变。随机抽取引起细胞病变的一份（命名为GXTL株）和不引起细胞病变的一份（命名为GXHP株）克隆与测序，并进行序列分析，发现GXTL株与猪腺病毒5型的同源性最高，达97.4%，GXHP株与猪腺病毒3型的同源性最高，达95.3%。属于猪腺病毒五型的GXTL株能引起细胞病变，而属于猪腺病毒三型的GXHP株不能引起细胞病变，这也许与病毒对细胞的适应能力有关。

四、结论

本试验用PK-15细胞分离到10株猪腺病毒，其中有四份能引起细胞病变，其余六份不引起细胞病变，随机抽取引起细胞病变的一份（GXTL株）和不引起细胞病变的 一份（GXHP）克隆与测序，经序列比较发现GXTL株与猪腺病毒五型的同源性最 高，达97.40l0，属于猪腺病毒五型，GXHP株与猪腺病毒三型的同源性最高，达95.3%属于猪腺病毒三型。

[1] 殷震，刘景华主编.动物病毒学[M]，北京：科技出版社，2003，833-836.

[2] 金玉霞.腺病毒六邻体蛋白的免疫学研究进展[J].国外医学免疫学分册，2005（06）

[3] 张霆，辛若雷.腺病毒六邻体蛋白型间线性化抗原位点的研究[J].中华试验和临床病毒学杂志2002， 16 （1） : 44-47