反复离心运动对大鼠骨骼肌损伤和蛋白质降解机制的影响

金其贯,刘 霞,李淑艳,常永娜,李宁川

反复离心运动对大鼠骨骼肌损伤和蛋白质降解机制的影响

金其贯,刘 霞,李淑艳,常永娜,李宁川

目的:探讨连续离心运动训练对骨骼肌中Calpain和Ubiquitin含量的影响及其与骨骼肌损伤之间的关系;方法:雄性SD大鼠29只随机分为对照组、离心训练后即刻组、24 h组和7天组。训练组大鼠连续进行7天的下坡跑运动,分别在末次训练后即刻,24 h和第7天取股四头肌,测定股四头肌的超微结构、血清LDH和CK活性以及骨骼肌中Calpain-1、Calpain-2和Ubiquitin含量;结果:1)7天离心训练后即刻和24 h,股四头肌超微结构的损伤性变化呈渐进性加重,离心训练后24 h组出现明显的肌丝坏死。训练后第7天仍不能完全恢复。血清CK和LDH活性的变化与大鼠股四头肌超微结构的变化相一致。2)与对照组相比,末次训练后即刻骨骼肌中Calpain-1、Calpain-2和Ubiquitin含量均显著升高;训练后24 h,Calpain-1和Calpain-2含量进一步升高,其中,Calpain-1显著高于对照组和训练后24 h组,Calpain-2虽显著高于对照组,但与训练后即刻组相比无显著性差异;而Ubiquitin含量显著低于训练后即刻组。训练后第7天,Calpain-1和Calpain-2含量显著低于训练后24 h组,但仍然高于对照组;而Ubiquitin含量虽高于训练后24 h组和对照组,但无显著性差异;结论:1)连续的离心运动可能对骨骼肌纤维的损伤产生一定的累加作用;2)短期连续的离心训练后,骨骼肌中Calpain和Ubiquitin的动态变化几乎与骨骼肌超微结构的动态变化相一致。离心运动训练导致骨骼肌中Calpain和Ubiquitin含量的增加,可能是导致骨骼肌累积性损伤的重要机制。

离心运动;骨骼肌;超微结构;肌肉损伤;Calpain;Ubiquitin;鼠;动物实验

随着国内外竞技体育日趋激烈的竞争,对高水平运动员的体力、体能要求越来越高,大运动量训练已成为各运动项目提高运动成绩的重要手段。研究证实,大运动量训练,尤其是离心运动或离心工作为主的运动会导致骨骼肌延迟性损伤[1,2,4],引起运动能力下降,且由钙依赖性蛋白酶(Calpain)和泛素(Ubiquitin)结合途径参与的肌肉蛋白的水解对肌肉的结构和功能变化均起到重要作用[5,7]。然而,反复离心运动对骨骼肌损伤的影响及其Calpain和Ubiquitin的变化规律目前还不完全清楚。本研究以大鼠为研究对象,通过观察连续离心运动训练7天后即刻、1天和7天骨骼肌超微结构、Calpain-1、Calpain-2、Ubiquitin含量以及血清CK和LDH活性的变化,探讨反复离心运动后骨骼肌损伤及其蛋白质的降解机制,为进一步研究运动延迟性肌肉损伤的发生机理与防治方法提供实验依据。组织,剪碎,移入玻璃匀浆器,加入预冷的生理盐水至总体积3 ml,在冰浴中用玻璃匀浆器仔细研磨,制备10%肌组织匀浆。将匀浆液低温离心(4℃,3 500 rpm)10 min,取上清液-80℃保存,以备测定Calpain-1和Calpain-2以及Ubiquitin蛋白的含量。

1.4 主要指标及其测试方法

肌组织透射电镜切片的制作在我校测试中心进行,仪器为荷兰PHILIPS公司生产的Tecnai 12型透射电子显微镜。血清LDH和CK采用全自动生化分析仪测试,试剂购自中生北控生物科技股份公司,仪器为日立7150型全自动生化分析仪。肌组织中Calpain-1和Calpain-2以及Ubiquitin蛋白的含量采用ELISA方法测定,ELISA试剂盒购自上海希美生物科技有限公司(RD产品),测定仪器为美国生产的ELX800型酶标仪;肌组织蛋白采用考马氏亮兰法测定,试剂盒购自南京建成生物研究所,测试仪器为日本产的UV-2450型分光光度计。

1.5 统计学分析

使用SPSS 13.0统计软件处理数据,结果用均数±标准差(X ±SD)表示,统计学分析采用单因素方差分析和独立样本t检验,P≤0.05表示为显著性差异,P≤0.01表示为极显著性差异。

1 材料与方法

1.1 动物分组

雄性SD大鼠29只,随机分为对照组(n=7)、离心训练后(Eccentric training,ET)即刻(ET0,n=7)、24 h(ET24, n=8)和训练后7天组(ET7d,n=7)。所有大鼠实验前均未进行过跑台运动。动物饲养室符合国家二级动物饲养标准,分笼饲养,每笼5只,饲养笼选用塑料制品,并配用不锈钢罩,玻璃吸水瓶和不绣钢吸水管,垫料为消毒碎木屑,每1～2天更换1次。饲养温度21℃～24℃,光照时间为12 h左右,国家标准固体混合饲料喂养,自由饮食。

1.2 实验方案

对照组:不进行任何形式的运动。

训练后即刻组(ET0):大鼠在在动物跑台上进行下坡跑,速度16 m/min,坡度为-16°,运动100 min后休息10 min,再运动100 min,总运动时间为200 min。连续7天,每天1次。在末次训练后即刻取材。

训练后24 h组(ET24):训练方案同训练后即刻组,在末次训练后24 h取材。

训练后7天组(ET7d):训练方案同训练后即刻组,在末次训练后第7天取材。

1.3 取材

将大鼠用2%的戊巴比妥腹腔注射进行麻醉,抽取静脉血2 ml,静置0.5 h后分离血清,并在3 h内测定血清中乳酸脱氢酶(LDH)和肌酸激酶(CK)活性。同时在股四头肌上取一小块肌肉,迅速切成一块米粒大小的组织块,置于5%的戊二醛溶液中固定,以备制作电镜切片;另取一块股四头肌迅速放入液氮中保存,然后准确称量0.3 g肌

2 结果

2.1 反复离心运动后各组大鼠骨骼肌超微结构的变化

如图1所示,对照组大鼠骨骼肌肌丝排列整齐,肌节结构完整,肌浆网清晰可见;7天离心训练后即刻,大鼠股四头肌的超微结构表现为肌原纤维排列不规则,肌丝排列卷曲,肌Z线变细,肌浆网增大、模糊。7天离心训练后24h组大鼠肌丝杂乱,断裂溶解,无明显完整的肌节结构,提示有肌丝坏死,在其附近线粒体大量增生,近圆形,水肿,在损伤的肌原纤维周围肌浆网消失。离心训练后7天,大鼠股四头肌的超微结构虽然与训练后即刻组和训练后24 h组相比,有显著改善,但是仍表现为肌原纤维排列不规则,肌节不完整,Z线变细,肌丝卷曲,肌浆网肿胀等。

图1 反复离心运动后各组大鼠股四头肌超微结构变化图Figure1 the changes of rat quadriceps ultrastructure in each group after repeated eccentric exercise

2.2 反复离心运动后各组大鼠血清LDH和CK活性的变化

如表1所示,大鼠经过连续7天的离心运动训练后即刻和24 h,血清LDH活性均显著高于对照组,训练后第7天血清LDH活性虽然显著低于训练后即刻组和训练后24 h组,但仍显著高于对照组。与此同时,大鼠经过连续7天的离心运动训练后即刻和24 h,血清CK活性均显著高于对照组,训练后第7天血清CK活性虽然显著低于训练后即刻组和训练后24 h组,但仍显著高于对照组。

表1 反复离心运动后血清LDH和CK活性动态变化一览表Table 1 The Dynamic Changes of Serum LDHand CK Activity after Repeated Eccentric Exercise

2.3 反复离心运动后各组大鼠肌组织中Calpain-1和Calpain-2以及Ubiquitin含量的变化

由表2所示,与对照组相比,末次训练后即刻骨骼肌中Calpain-1、Calpain-2和Ubiquitin含量均显著升高;末次训练后24 h,Calpain-1和Calpain-2含量进一步升高,其中, Calpain-1显著高于对照组和训练后即刻组,Calpain-2虽显著高于对照组,但与训练后即刻组相比无显著性差异;而Ubiquitin含量显著低于训练后即刻组。末次训练后第7天,Caipain-1和Calpain-2含量显著低于训练后24 h组,但仍然高于对照组;而Ubiquitin含量虽高于训练后24 h组和对照组,但均无显著性差异。

表2 反复离心运动后各组大鼠肌组织中Calpain-1、Calpain-2和Ubiquitin含量变化一览表Table 2 The Dynamic Changes of Calpain-1, Calpain-2 and Ubiquitin Content in Muscle after Repeated Eccentric Exercise

3 讨论

3.1 反复离心运动对大鼠骨骼肌超微结构的影响

在体育运动中,骨骼肌损伤多见于周期性运动的耐力项目,它是因反复运动所致的肌纤维损伤,并且易发于骨骼肌离心运动时相[4]。然而,连续性的离心运动训练与骨骼肌损伤之间的研究却不多见,且研究结果也并不一致[1,2,4,6,8,9]。有研究发现,向心运动训练可以增加离心运动所致的延迟性肌肉损伤的敏感性[8],而先前的离心训练对后续的损伤性运动引起的骨骼肌损伤具有一定的保护作用[6]。但是,有研究发现,先前的向心运动训练并不能加剧离心运动所致的肌肉损伤,与向心训练相比,离心训练也不能缓和肌肉损伤的程度[9]。有学者让大鼠进行1次离心运动和1周的离心训练,比较了运动后即刻、运动后1～7天大鼠股四头肌超微结构的变化。结果发现,连续7天同样强度运动后骨骼肌超微结构的破坏无积累现象,停止运动后7天基本恢复。与此同时,他们进行了人体试验,让大学生进行1次离心运动和1周的离心训练,同样比较了运动后即刻、运动后1～7天血清CK活性和Mb的含量以及肌肉酸痛的程度,结果发现,与对照组相比,从1次离心运动后即刻开始血清CK和Mb含量均显著升高,运动后第3天达峰值,运动后第7天恢复到安静时水平。而1周运动组从末次训练结束,血清CK活性和Mb含量均显著高于对照组,末次训练后第7天虽有恢复,但仍显著高于对照组。与此同时,与1次运动组相比,在运动后1～7天,血清CK活性和Mb含量以及肌肉的酸痛程度均显著升高(P≤0.05)[2]。由此可见,人体试验反映肌肉损伤的生化标志物的变化和动物试验中骨骼肌的超微结构变化之间存在不一致的现象。

为了进一步研究连续离心运动训练对骨骼肌超微结构的影响,本研究让大鼠在跑台上进行连续7天的下坡跑训练,观察了在末次训练即刻、24 h和训练后第7天大鼠股四头肌的超微结构以及血清LDH和CK活性的变化。结构发现,7天离心训练后即刻,大鼠股四头肌的超微结构表现为肌原纤维排列不规则,肌丝排列卷曲,Z线变细,肌浆网增大、模糊。末次训练后24 h组大鼠肌丝杂乱,断裂溶解,无明显完整的肌节结构,提示有肌丝坏死,在其附近线粒体大量增生,近圆形,水肿,在损伤的肌原纤维周围肌浆网消失。7天离心训练后第7天,大鼠股四头肌的超微结构虽然与训练后即刻组和训练后24 h组相比,有显著改善,但是仍表现为肌原纤维排列不规则,肌节不完整, Z线变细,肌丝卷曲,肌浆网肿胀等。另外,大鼠经过连续7天的离心运动训练后即刻和24 h,血清LDH和CK活性均显著高于对照组,训练后第7天血清LDH和CK活性虽然显著低于训练后即刻组和训练后24 h组,但仍显著高于对照组。由此可见,连续7天的离心运动训练后,大鼠股四头肌发生了较为严重的损伤,末次训练后第7天肌肉的损伤仍不能完全恢复。血清CK和LDH活性的变化与大鼠股四头肌超微结构的变化相一致。从而说明,在短时间内进行连续大强度的离心运动可能导致骨骼肌纤维的损伤产生一定的累加作用,骨骼肌对损伤并不能产生良好的适应,这与罗杰伟的结果相似[1]。

3.2 反复离心运动对大鼠骨骼肌Calpains和Ubiquitin含量的影响

蛋白质是骨骼肌的基本组成成分。骨骼肌的收缩装置是由一系列高度规则有序的特定蛋白质构成的。骨骼肌中的收缩蛋白和维持正常形态结构的细胞骨架也是由特定形态和结构的蛋白构成的。大强度或不习惯的运动,尤其是离心工作可导致细胞骨架破坏,收缩装置中Z盘破坏,收缩蛋白损伤,并伴随着血浆肌红蛋白(Mb)、肌酸激酶(CK)水平上升,而运动后骨骼肌的这些损伤性变化可能与骨骼肌蛋白的降解有关。

研究表明,Calpain系统和Ubiquitin途径可能是运动延迟性肌肉损伤中组织结构破坏的重要机制[5,7]。体外实验证明,Calpain能从Z板处释放α-肌动蛋白和肌凝蛋白,这种依赖Calpain系统释放肌动蛋白和肌凝蛋白的过程的发生早于泛素对肌肉蛋白的水解作用[10]。μ-calpain(Calpain-1)和m-calpain(Calpain-2)在体外可水解多种骨骼肌骨架蛋白,因此,Calpain的激活被认为启动了肌肉蛋白水解系统,从而导致进一步的肌肉结构和功能改变以及肌肉损伤。而Calpains和Ubiquitin途径在反复运动导致的肌肉损伤过程中的变化规律尚未明了。最近有学者研究了重复离心运动对骨骼肌损伤以及Calpain-Calpastatin基因表达的影响。他们让受试者进行1组负重台阶试验,观察了在运动前、运动后3 h、24 h和运动后第3、5、7天骨骼肌中Calpain系统以及Calpastatin基因表达的情况。在第1次运动试验后8周,再次重复同样的实验。结果发现,第2次离心运动后肌肉最大随意收缩力量的下降程度、肌肉酸痛程度以及血浆Mb、CK活性的升高幅度均比第1次运动后显著降低;在2次运动后Calpain-1的基因表达均无显著性变化,与运动前相比,Calpain-2的基因表达在第1次运动后24 h上升42%,而在第2次运动后24 h上升65%,且具有显著性差异(P<0.05);而Calpain-3的基因表达在2次运动后随着时间的延长表现为显著性下调(P<0.01),但在2次运动后的相同时段无显著性差异[12]。另外,又有学者研究了不同负荷长期跑台运动对大鼠腓肠肌calpains和calpastatin mRNA及活性表达的影响。结果发现,与对照组相比,μ-calpain和m-calpain的mRNA表达均无明显改变,n-calpain mRNA表达在小负荷运动3周和大负荷运动5周后下降。m-calpain活性在大负荷和小负荷运动3周和5周后显著升高;μ-calpain活性在小负荷运动3周、5周和大负荷运动3周、5周和7周后显著下降。n-calpain活性运动后呈下降趋势,但无显著性差异。从而认为,mcalpain与μ-calpain、n-calpain在运动后呈现不同的变化趋势,调节机制不尽相同,升高的m-calpain活性在运动性肌肉损伤过程中可能起到重要作用,长时间重复性运动可使m-calpain对运动产生适应。μ-calpain在长期跑台运动后并未表现出明显差异,n-calpain活性的下降及calpastatin活性的升高可能与肌肉损伤有关[3]。而有学者研究了对重复离心运动引起的肌肉损伤的细胞适应,他们让受试者在相隔5.5周进行了2次离心运动,结果发现,第2次离心运动后血清CK活性升高幅度显著降低,骨骼肌Z线流只出现在第1次运动后,而2次运动后,骨骼肌中Calpain含量保持不变,但Ubiquitin结合蛋白含量显著升高,且第2次离心运动后升高幅度更大。从而认为骨骼肌对离心运动的适应主要表现在Ubiquitin途径蛋白水解活性的增加和血清CK活性的减弱[11],造成这些研究结果的差异可能是由于实验方案的不同。

为了进一步研究连续离心运动训练对骨骼肌中Calpain和Ubiquitin含量的影响及其与骨骼肌损伤之间的关系,本研究让大鼠在跑台上进行了连续7天的下坡跑训练,在末次训练后即刻、24 h和第7天,测定了股四头肌中Calpain-1、Calpain-2和Ubiquitin含量。结果发现,与对照组相比,末次训练后即刻骨骼肌中Calpain-1、Calpain-2和Ubiquitin含量均显著升高;末次训练后24h,Calpain-1和Calpain-2含量进一步升高,其中,Calpain-1显著高于对照组和训练后即刻组,Calpain-2虽显著高于对照组,但与训练后即刻组相比无显著性差异;而Ubiquitin含量显著低于训练后即刻组。训练后第7天,Calpain-1和Calpain-2含量显著低于训练后24 h组,但仍然高于对照组;而Ubiquitin含量虽高于训练后24 h组和对照组,但均无显著性差异。而且它们的动态变化几乎与骨骼肌超微结构的动态变化相一致。从而说明,短期连续的离心运动训练可能导致骨骼肌中Calpain和Ubiquitin含量的增加,这些变化可能是导致骨骼肌累积性损伤的重要机制。因此,在运动训练的实际中,当运动员在进行大强度的离心运动训练时,特别是在训练的早期,应该采取适当的干预措施,如采用钙离子抑制剂、增加蛋白质等,通过抑制骨骼肌中Calpain或Ubiquitin途径减轻骨骼肌蛋白的降解,防止骨骼肌的累积性损伤,但其有效措施还有待于进一步研究。研究[J].中国运动医学杂志,2003,22(2):138-142.

[3]王立靖,段立公,李旭坤,等.不同负荷长期跑台运动对大鼠腓肠肌calpains和calpastatin mRNA及活性表达的影响[J].中国运动医学杂志,2008,27(5):579-583.

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4 结论

1.在短时间内进行连续大强度的离心运动可能对骨骼肌纤维的损伤产生一定的累加作用,骨骼肌对损伤并不能产生良好的适应。

2.短期连续的离心训练后的骨骼肌中,Calpain和Ubiquitin的动态变化几乎与骨骼肌超微结构的动态变化相一致。离心运动训练导致骨骼肌中Calpain和Ubiquitin含量的增加,可能是导致骨骼肌累积性损伤的重要机制。

[1]罗吉伟,余斌,覃承诃,等.反复力竭运动后大鼠骨骼肌线粒体超微结构改变及维生素E的保护作用[J].第一军医大学学报, 2003,23(12):1326-1328.

[2]田野,马鹏鹏,郭时杰,等.连续运动后延迟性肌肉损伤的适应性

Effects of Repeated Eccentric Exercise on Skeletal Muscle Injury and the Mechanism of Proteolysis in Rat

J IN Qi-guan,LIU Xia,LI Shu-yan,CHANG Yong-na,LI Ning-chuan

Objective:To investigate the effects of continuous eccentric exercise training on Calpain and Ubiquitin content skeletal muscle and its relationship with skeletal muscle injury. Methods:29 male SD rats were randomly divided into control group,immediately post-training group(ET0),24h post-training group(ET24)and 7 days post-training group(ET7d).Training rats consecutive downhill running for 7 days.Quadriceps were taken immediately,24h and 7th day after the last bout of eccentric exercise respectively,the changes of ultrastructure,serum LDH and CK activity and Calpain-1,calpain-2,Ubiquitin concentrations were observed. Results:1)Ultrastructural changes of quadriceps injury showed gradual increase immediately and 24h at the last bout of eccentric exercise,the apparent necrosis of myofilament occurred at 24h post-training.It still not fully recovered at 7th day after training.The changes of serum CK and LDH activity had consistent with ultrastructural changes.2)Compared with the control group,Calpain-1,Calpain-2 and Ubiquitin levels in skeletal muscle were significantly increased immediately after the last training.At 24h post-training,Calpain-1 and Calpain-2 levels further increased,including Calpain-1 significantly higher than that in control group and ET0 group,Calpain-2 significantly higher than in control group,but there was no significant difference compared with ET0 group,while Ubiquitin content was significantly lower than that in ET0 group.At the 7th post-training,Caipain-1 and Calpain-2 were significantly lower than those in ET24 group,but still higher than control group.While Ubiquitin levels in ET7d group was higher than that in ET24 group and the control group,but there were no significant difference.Conclusion:1)Repeated eccentric exercise might produce a certain cumulative effect on skeletal muscle damage.2)The dynamic changes of Calpain and Ubiquitin content in skeletal muscle after short-term repeated eccentric training was almost consistent with the dynamic changes of skeletal muscle ultrastructure.Eccentric exercise training might result in the in-crease of Calpain and Ubiquitin levels in skeletal muscle,which might be an important mechanism about cumulative damage of skeletal muscle.

repeated eccentric exercise;skeletal muscle;ultrastructure;muscle injury;Calpain; Ubiquitin

G804.7 文献标识码:A

1000-677X(2010)06-0076-05

2010-04-16;

2010-05-22

国家体育总局应用基础研究项目(IK0408208)。

金其贯(1965-),男,江苏兴化人,教授,博士,硕士研究生导师,主要研究方向为运动生理和身体机能评定,Tel: (0514)87997009,E-mail:qgjin@yzu.edu.cn;刘霞(1972-),女,湖南临澧人,副教授,博士,硕士研究生导师,研究方向为运动能力提高的解剖、生理机制,Tel: (0514)87991082,E-mail:liuxia727@sohu.com;李淑艳(1978-),女,山东潍坊人,讲师,硕士,研究方向为运动解剖,Tel:(0514)87991082,E-mail:leeshuyan01@sina. com;常永娜(1983-),女,河南新乡人,E-mail: chunzhang531@163.com;李宁川(1965-),男,江苏盐城人,教授,博士,硕士研究生导师,研究方向为运动生物化学,Tel:(0514)87997009,E-mail:linc@yzu.edu.cn。

扬州大学体育学院,江苏扬州225002 Yangzhou University,Yangzhou 225002,China.