快速纯化新生大鼠许旺细胞的新方法

祝加学 沈尊理 秦金保 张涛 金羽青 周广东

快速纯化新生大鼠许旺细胞的新方法

祝加学 沈尊理 秦金保 张涛 金羽青 周广东

目的探讨一种简单高效的许旺细胞纯化方法。方法选用3～5 d的SD乳鼠双侧坐骨神经，用DispaseⅡ短时消化去除神经外膜和束膜，用复合胶原酶NB4彻底消化、离心，获得原代细胞。细胞培养达到亚融合状态后，置于4℃冰箱约5min，收集首先脱壁的许旺细胞。最后用S100免疫荧光法和流式细胞仪法鉴定许旺细胞的纯度。结果通过酶消化法剥脱神经外膜和束膜，获得纯度85%以上的原代许旺细胞；经低温差速法进一步纯化，纯度可达99%。结论先用酶消化神经外膜和束膜，再用低温差速分离许旺细胞，能够获得高纯度的许旺细胞，是一种简便高效的纯化手段。

许旺氏细胞纯化低温

许旺细胞是重要的神经胶质细胞，在中枢和外周神经损伤后的修复中发挥重要作用[1－4]。近年来的研究发现，许旺细胞与干细胞共培养可以促进干细胞分化为类神经细胞[5－7]，但是该方法需要高纯度的许旺细胞。有两种方法可以提高许旺细胞的纯度：一是通过去除神经外膜提高原代细胞的纯度；另一种是在培养传代过程中，采取各种方法去除成纤维细胞的污染。但是这两种方法都不能在短时间内获得高纯度的许旺细胞，而且具有耗资多、效率低等缺点。在提高原代许旺细胞纯度方面，尽管在显微镜下剥离去除神经外膜，可以减少成纤维细胞的污染[11]，但是采用目前的设备技术，仍然难以达到彻底去除神经束膜的目的。乳鼠许旺细胞的增殖能力较成年鼠强，且取材容易，是许旺细胞研究的主要细胞来源，但是因为其神经细小，更难通过显微技术去除外膜。而在许旺细胞的培养扩增过程中，主要的困难就是成纤维细胞的污染。针对这一问题，目前仍以有丝分裂抑制剂抑制成纤维细胞分裂法和酶消化差速贴壁法为主[8-10]。但是，有丝分裂剂对细胞的有丝分裂缺乏针对性，同样也会抑制处于分裂旺盛期的许旺细胞增殖；酶消化差速贴壁法只是在培养传代过程中减少成纤维细胞的污染，需要反复多次纯化才能得到高纯度的许旺细胞，因此酶消耗大、步骤繁琐且耗时较长。

本研究尝试先用DispaseⅡ酶消化法，去除乳鼠神经束膜和外膜，胶原酶消化分离获得原代细胞，再用低温差速分离法进一步纯化，从原代和传代两个层面纯化，以期在短时间内获得高纯度的许旺细胞。

1 材料与方法

1.1 动物

新生SD乳鼠（3～5日龄，上海斯莱克实验动物有限公司）18只。

1.2 方法

1.2.1 培养瓶的铺层

在培养瓶内加入含400 ng/mL层粘连蛋白（LN，罗氏公司）的DMEM溶液（100μl/cm2），水平振荡培养瓶至液体均匀铺满瓶底，将培养瓶放入37℃、5%CO2细胞培养箱内孵育1 h，吸除液体后备用。

1.2.2 许旺细胞培养液的配制

许旺细胞培养液（Schwann cellsculturemedia，SCCM），含10%胎牛血清（FBS，Hyclone公司）的DMEM溶液，加入1mM左旋谷氨酰胺（Sigma公司）、2μM Forskolin（Sigma公司）、1 ng/mLHeregulin-β-1（Pepro Tech公司），混匀后，4℃冰箱保存备用。

1.2.3 原代许旺细胞的获取

取新生3～5 d的小鼠，脱臼处死后，在75%乙醇内浸泡消毒15min。在解剖显微镜下手术获取双侧坐骨神经（SN），将SN浸入装有40mLPBS的50mL离心管中，冰上孵育待用。SN获取完毕后，600 g离心，负压吸除PBS，加入1 mL 0.2%DispaseⅡ，放入细胞培养箱内，37℃孵育30min。轻轻摇晃试管，使SN呈丝状，自然沉淀后，吸去消化液（将消化液进行离心，所获细胞种植于培养瓶中），PBS清洗1次，离心获得丝状的神经组织。加入0.2%复合胶原酶NB4放置30 min，彻底消化神经组织，用巴氏管反复吹打2～5min，至组织块呈细微碎片（此时消化液较混浊，无明显大组织块）。600 g离心5 min，弃上清，加入SCCM重悬至（2.0～2.5）×105cells/mL，接种入LN铺盘后的培养瓶培养。

1.2.4 许旺细胞的纯化与扩增

原代细胞培养48 h后，将培养瓶放入4℃冰箱中，约5min后取出，轻轻拍打培养瓶壁1～3min，使许旺细胞脱离瓶壁入培养液中。收集悬液入15mL离心管，600 g离心5min，弃上清，加入SCCM，重悬细胞。1∶1接种于新的培养瓶继续培养48 h。

1.2.5 许旺细胞的形态学鉴定

在培养瓶中，许旺细胞形态较特异，胞体细长呈梭形、双极或三极、核浆比例小、折光性强，较易与胞体扁平不规则形、核浆比例较大、折光性差的成纤维细胞鉴别。此外，在体外培养中，相邻的许旺细胞会首尾相连，形成链状或网状的特异形态，而成纤维细胞则相互融合呈片状。

1.2.6 许旺细胞的免疫细胞化学鉴定

许旺细胞特异性表达S100β蛋白，可用以鉴定SC。负压吸除SCCM，加入0.05%Trypsin-EDTA消化1min，FBS终止消化。600 g离心5min，弃上清，加适量SCCM，重悬细胞至（2.0～2.5）×106cells/mL。将细胞悬液滴于载玻片上，每张100μL，在37℃细胞培养箱内孵育30～40min后，加入适量SCCM培养24～48 h。负压吸除SCCM，4%多聚甲醛溶液于室温下固定5min。PBS漂洗3次，每次3min。10%羊血清室温封闭10min。加入兔抗S100抗体（1∶500），37℃孵育60min或4℃过夜。PBS漂洗3次，每次5min。加入CY3-羊抗兔IgG抗体（1∶200），37℃孵育30min。PBS漂洗3次，每次5min。DAPI核衬染10 s，PBS漂洗5min。荧光封片剂封片，荧光显微镜观察并拍摄。

1.2.7 流式细胞仪鉴定许旺细胞的纯度

负压吸除培养皿内培养液，PBS漂洗1次后加入3～4mL的0.05%Trypsin-EDTA，至大多数细胞收缩变圆、透亮时即加入30μL FBS（或含有10% FBS的培养液3mL）终止消化。将液体经40μm滤网过滤后，收集入50 mL离心管，600 g离心5 min，弃上清；用含4%FCS的PBS重悬至1.0×107cells/mL，每100μL分装入一支15mL离心管中；分别加入兔抗P75（1∶500），4℃下避光孵育30 min。分别加入含4%FCS的PBS漂洗，600 g离心5min，弃上清，重复漂洗3次。用100μL含4%FCS的PBS重悬细胞，加入二抗FITC-羊抗兔IgG抗体（1∶500，PBS稀释），4℃下避光孵育30min。分别加入10mL含4%FCS的PBS漂洗，600 g离心5 min，弃上清，重复漂洗3次。用含4%FCS的PBS重悬细胞，冰上孵育待测。

1.2.8 细胞计数

取每次纯化所得的细胞悬液各20μL，以血细胞计数板进行细胞计数，此时获得的为纯化后所得的细胞量。第60小时，用0.05%Trypsin-EDTA消化1～3 min，以获得所有的贴壁细胞；细胞悬液收集后，取20μL用血细胞计数板进行细胞计数，此时所得为最终的细胞获得量。

1.3 统计学方法

每次实验种6瓶细胞，3瓶一组，共进行3次实验。原代细胞与纯化后的第1代细胞进行纯度比较，计数值以均数±标准差表示，应用SPSS 10.0统计软件进行数据分析。组间均数比较采用t检验，P＜0.01为差异具有显著意义。

2 结果

2.1 许旺细胞的获取与原代培养

经酶及机械消化后，所获得的细胞接种于LN铺盘后的培养瓶，6 h后即见绝大多数细胞已经贴壁。随着进一步培养，贴壁细胞逐渐伸展，最终形成两类形态各异的细胞：一类为许旺细胞，胞体较小，呈梭形，双极或三极，核浆比例小，胞核椭圆形，胞体折光性强；另一类为成纤维细胞，细胞较大，呈扁平多边或不规则形，核浆比例大，胞核圆而大，胞体折光性差。在前48 h的培养过程中，许旺细胞的分裂速度明显快于成纤维细胞；72 h后，成纤维细胞增殖加快，并迅速成为优势生长的细胞而铺满瓶底，此时多数许旺细胞被迫迁移并重叠到成纤维细胞的上方。上清液离心所获得细胞中以成纤维细胞为主，只有极少量许旺细胞（图1）。

图1 原代细胞的显微镜下观察（绿色箭头所示为许旺细胞，红色箭头所示为成纤维细胞）

2.2 许旺细胞的纯化

将培养瓶置于4℃冰箱中约5 min后，倒置相差显微镜下观察：大多数双极和三极的细胞收缩，折光性明显增加；而成纤维细胞则形态学改变不明显并贴壁牢固。轻轻拍打瓶壁1～3min，见大多数许旺细胞浮起，而成纤维细胞仍然贴壁完好（图2）。

图2 纯化过程中细胞的显微镜下观察（绿色箭头所示为许旺细胞，红色箭头所示为成纤维细胞）

2.3 许旺细胞的鉴定

经体外继续培养的许旺细胞，在3 d后大多排列成链状或网状。经S100β蛋白的免疫荧光染色，发现几乎所有的双极及三极样细胞为阳性，而残余的扁平圆核不规则细胞均为阴性（图3）。

图3 细胞的免疫荧光染色（40×）（绿色箭头所示为许旺细胞，白色箭头所示为成纤维细胞）

2.4 许旺细胞的纯度鉴定

原代许旺细胞贴壁24 h，许旺细胞的纯度为85%；原代细胞培养48 h，经过进一步纯化后，再次贴壁24 h，许旺细胞的纯度为99.6%（图4）。

图4 实验组和对照组的流式细胞检测

2.5 细胞扩增计数

重复3次实验，二次纯化所得的许旺细胞纯度均高于99%。第1代细胞的纯度均显著高于原代，差异具有统计学意义（P＜0.01）。

3 讨论

许旺细胞的体内、外研究及组织工程化神经导管的构建都需要制备高纯度的许旺细胞[2，4]，而且高纯度许旺细胞与间充质干细胞共培养可诱导出类神经元[5－7]。然而，在许旺细胞的体外培养中，成纤维细胞的优势生长一直都是制约许旺细胞体外培养纯化的主要因素。尽管目前已有许多许旺细胞的纯化方法，如无血清或低血清培养法[12]、抗有丝分裂处理结合胰酶差速消化法[13]、免疫选择法、复合胶原酶差速消化法及体外预变性结合复合胶原酶差速消化法[9－10]等，然而这些方法各有缺点。无血清或低血清培养法，不仅降低成纤维细胞的增殖，许旺细胞的增殖也明显受到抑制。抗有丝分裂剂，非特异地作用于所有的进行有丝分裂的细胞，因而在减少快速增殖的成纤维细胞的同时，也抑制了处于有丝分裂旺盛期的许旺细胞增殖。免疫选择法，需要大量抗体及大型分选设备，增加了细胞污染的概率，耗费资金较多[14]。而各类消化酶差速消化法及体外预变性的方法，大多费时较长，难以在短时间内获得大量高纯度的许旺细胞。

我们通过DispaseⅡ初步消化神经，去除神经外膜和束膜，可获得相对较高纯度的原代许旺细胞，再利用许旺细胞和成纤维细胞对低温作用的不同反应，通过降低培养瓶内的温度，促使许旺细胞首先脱壁，进一步纯化许旺细胞，可使许旺细胞的纯度达到99%以上。采用以上方法，可以在短时间内获得高纯度的许旺细胞，且较经济方便。为验证DispaseⅡ对神经外膜和束膜的消化具有特异性，我们将首次酶消化过程中获得的混合液离心，所得细胞种植于培养瓶中培养，发现只有少量许旺细胞，因此DispaseII对神经段的消化，不会造成许旺细胞的大量丢失。在纯化原代许旺细胞过程中，需要严格控制培养瓶放置入冰箱的时间：作用时间过短，许旺细胞不脱壁；而作用时间过长，成纤维细胞也会大量脱壁，达不到纯化目的。我们发现，作用5min左右比较合适。

综上所述，我们用DispaseⅡ消化去除神经外膜和束膜，可以获得高纯度的原代许旺细胞，首次传代时再用低温差速分离法进一步纯化，在48 h内就能获得满足需要的高纯度许旺细胞。

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A Novel Approach to Rapid and High-efficiency Purification of Schwann Cells in Rats

ZHU Jiaxue1,SHEN Zunli1, QIN Jinbao1,ZHANG Tao2,JIN Yuqin1,ZHOU Guangdong3.
1 Department of Plastic Surgery,Shanghai First People′s Hospital，Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200080,China;2 Department of Gynaecology and Obstetrics,Shanghai Ninth People′s Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200111,China;3 Department of Plastic and Reconstructive Surgery,Shanghai Ninth People′s Hospital，Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai200111,China.Corresponding author:SHEN Zunli.

ObjectiveTo explore a simplemethod for high-purity enrichmentof Schwann cells(SCs).M ethodsThe sciatic nervewas dissected from both limbs of the neonatal Sprague-Dawley(SD)rat(3－5 days old).The nervewas first digested by dispaseⅡto remove epineurium and perineurium,and then by collagenase NB4 to obtain primary SCs.The cells were centrifuged and cultured until confluence in a flask.Then the flask was placed in refrigerator(4℃)for 5 minutes.At such a low temperature,SCsmostly detached from the innerwall,while the other cells remained adherent.The SC purity was identified by S100 immunofluorescence double staining and flow cytometry.ResultsThe purity was above 85%after enzyme digestion,and reached 99%after low-temperature treatment.ConclusionEnzyme digestion in conjunction with low temperature treatment is a simple and efficientway to obtain Schwann cellswith high purity.

Schwann cells;Purification;Low-temperature

book=141,ebook=5

Q813.1+1

A

1673－0364（2010）03－0141－04

10.3969/j.issn.1673-0364.2010.03.005

2010年3月16日；

2010年3月23日)

国家自然科学基金（30872630）。

200080上海市上海交通大学医学院附属第一人民医院整形外科（祝加学，沈尊理，秦金保，金羽青）；200011上海市上海交通大学医学院附属第九人民医院妇产科（张涛）；整复外科（周广东）。

沈尊理。