小鼠孤雌胚胎干细胞系的建立

王彦 钱德俭 韦多 徐凯 宦晴 吕鸿 高选 陈子江

小鼠孤雌胚胎干细胞系的建立

王彦 钱德俭 韦多 徐凯 宦晴 吕鸿 高选 陈子江

目的利用化学激活的技术，建立小鼠孤雌胚胎干细胞系。方法用钙离子载体A23187和6-二甲基氨基嘌呤（6-DMAP）处理小鼠卵母细胞，待囊胚形成后，分离内细胞团，细胞传代、扩增。待传至37代时，核型检测查染色体，用微卫星技术进行纯合性鉴定，用免疫荧光技术检测胚胎干细胞表面标记Oct-4、SSEA-1及SSEA-4的表达情况，并用畸胎瘤试验检测其多向分化能力。结果该细胞株为孤雌来源,表现为正常二倍体核型，表达ALK，表面标志物Oct-4、SSEA-1阳性，SSEA-4阴性。体内注射后，在局部形成含三个胚层组织的畸胎瘤。结论通过钙离子载体A23187和6-DMAP化学激活小鼠卵母细胞，可以得到具有胚胎干细胞特性的细胞株。

孤雌激活胚胎干细胞钙离子载体A23187 6-二甲基氨基嘌呤

胚胎干细胞(Embryonic stem cells，ESCs)，源于发育5～7 d的囊胚的内细胞团（Inner cellmass，ICM），具有无限增殖和多向分化的特征。按其来源分为正常胚胎来源（绝大多数）、核移植来源和孤雌来源。

孤雌生殖是指卵子在没有雄性配子作用的情况下，以外在因素予以激活。孤雌激活的卵子，在低等动物如两栖类可以产生正常后代个体，在高等动物则仅发育到囊胚阶段，不能继续发育成后代个体。最近有文献报道，与受精卵来源的ESCs一样，孤雌来源的ESCs同样具有无限增殖和多向分化潜能，可在体外诱导分化成各种细胞。因此，若能建立孤雌生殖胚胎干细胞系（Parthenogenetic embryonic stem cells，PGES），可以避免受精卵来源ESCs引发的宗教、道德和伦理等方面的争议，有助于进一步推动ESCs的研究和应用。

本实验拟探索一种高效的PGES细胞建系的方法，并进行了相关的细胞生物学鉴定。

1 材料和方法

1.1 材料

6周龄昆明系雌性小鼠（体重22 g）购自山东大学医学院动物实验中心，清洁级，适应养殖7 d，普通饲养。重度联合免疫缺陷（Severe combined im-mune deficiency，SCID）小鼠购自中科院上海生化细胞所。

孕马血清促性腺激素（Pregnantmare’s serum gonadotropin，PMSG）、人绒毛膜促性腺激素（Human chorionic gonadotropin，hHCG）、钙离子载体A23187和6－二甲基氨基嘌呤（6－Dimethylaminopurine，6-DMAP）购自Sigma公司；人类输卵管液（H uman tubalfluidmedium，HTF）、胚胎培养液G1购自Vitrolife公司；Knockout-DMEM、血清替代物、谷氨酰胺、非必须氨基酸和β-巯基乙醇购自Gibco公司；bFGF购自Chemicon公司；解剖显微镜购自Motic公司；Oct-4抗体（兔抗小鼠多抗）、SSEA-1（兔抗小鼠多抗）和SSEA-4抗体（兔抗小鼠多抗）购自中科院上海生化细胞所。

1.2 方法

1.2.1 卵母细胞的收集

选择6周龄雌性小鼠10只，每只腹腔内先注射PMSG 10 U，48 h后再注射hHCG 10U，过13～17 h断颈处死；摘除输卵管，注射针挑破输卵管壶腹部，收集卵丘-卵母细胞复合体，置于胚胎培养液G1中备用。

1.2.2 卵母细胞的孤雌激活

用A23187和6-DMAP进行化学激活卵母细胞：以80μg/mL透明质酸酶消化30 s，用HTF洗3遍，再置于含5μmol／L A23187的HTF中，37℃避光放置5min，以HTF洗涤3次后，置于含10μg/mL 6-DMAP的HTF中，在37℃、5%CO2培养箱中培养4 h后进行激活处理，再以G1进行胚胎培养，胚胎分裂为8细胞后换液，以G2继续培养至囊胚阶段。

1.2.3 PGES细胞的分离和培养

取出囊胚，以机械法分离出内细胞团细胞，在铺有饲养层细胞的培养皿中传代、扩增。培养液为高糖DMEM，内含20%knock-out血清替代物、1%非必需氨基酸、1 mM L-谷氨酰胺、0.1 mMβ-巯基乙醇、4 ng/mL碱性成纤维细胞生长因子。37℃、5%CO2培养箱中培养，3～5 d后以0.05%胰酶消化，常规传代。

1.2.4 PGES细胞的鉴定

1.2.4.1 纯合性鉴定

采用微卫星技术进行检测，具体方法参照文献[1]。

1.2.4.2 特异性细胞表面标记鉴定

取PGES细胞爬片，设置实验组、空白对照组和阴性对照组（小鼠成纤维细胞）。实验组与阴性对照组细胞爬片滴加一抗（兔抗小鼠Oct-4，SSEA-1抗体1∶50），空白组滴加PBS，置湿盒内于4℃冰箱内过夜，PBS漂洗5min（3次），滴加二抗（FITC、IgG），37℃，30min，镜下观察并拍照。

1.2.4.3 核型检测

0.5μg/mL秋水仙素作用6 h，1 mg/mLⅣ型胶原酶消化10min，解剖镜下收集ES细胞。低渗、固定、制片按常规方法进行。

1.2.4.4 体内分化能力鉴定

在SCID小鼠腋下每注射点接种1.5×105cells/mL的PGES细胞，培养6～8周，取生成的肿块切片、常规HE染色，观察PGES细胞在体内的生长、分化情况。

2 结果

2.1 卵母细胞的收集

对于6周龄昆明系小鼠，PMSG和HCG可有效地超促排卵，5只小鼠共获得卵母细胞156个（图1）。

图1 小鼠卵母细胞（经透明质酸处理后，已去除周边颗粒细胞）

2.2 卵母细胞的激活

经A23187联合6－2DMAP作用后，共有138个卵母细胞被激活（激活率88.46%），其中109个发生卵裂（卵裂率78.98%），最终形成囊胚56个（囊胚形成率40.58%）（图2）。

图2 孤雌激活后不同发育时期的胚胎（100×）

2.3 PGES细胞的分离和培养

体外培养胚胎至囊胚形成，以机械法分离内细胞团细胞（图3A），在铺有饲养层细胞的培养皿中传代、扩增。未分化的PGES细胞呈鸟巢状生长，形成的克隆较扁平，结构均匀，细胞界限不清（图3B）。

图3 PGES细胞的培养

2.4 PGES细胞的鉴定

微卫星技术检测结果显示，该PGES细胞株为孤雌来源（图4）。ES细胞特异性细胞表面标志物Oct-4、SSEA-1阳性，SSEA-4阴性（图5－7）。核型检测示40，XX（图8）。将PGES细胞接种于SCID小鼠皮下，8周可见肿块生成，切片，HE染色，可见三个胚层的组织（图9）。

图4 2%琼脂糖凝胶电泳

图5 Oct-4阳性（左：荧光显微镜；右：相差显微镜。40×）

图6 SSEA-1阳性（左：荧光显微镜；右：相差显微镜。40×）

图7 SSEA－4阴性（左：荧光显微镜；右：相差显微镜。40×）

图8 核型染色（40，XX）

神经组织（外胚层）肌肉组织（中胚层）

图9 畸胎瘤切片HE染色（40×）

3 讨论

所谓孤雌生殖是在无需精子的条件下，自发或经物理、化学刺激，使卵母细胞有丝分裂激活而形成胚胎，并可继续发育成熟而产生后代[2]。许多动物都有孤雌生殖现象，如昆虫类的蟑螂、苍蝇、蚂蚁、蜜蜂，脊椎动物类的蜥蜴、蛇、鱼、鸟及两栖动物等[3]。而畸胎瘤则是孤雌生殖在人体的病理性体现。

孤雌生殖技术也是建立胚胎干细胞系的一项重要技术[5]，孤雌激活的卵母细胞能够在某种程度上替代受精卵，以研究卵母细胞的激活进程及原核胚胎的形成[4]，可用于基因治疗、器官移植、组织修复、疾病治疗等诸多领域。多年来，人们一直在探索孤雌激活的方法，以期卵母细胞达到最大比例的激活并使激活后的细胞能最大程度地发育，直至胚胎形成[5－6]。激活方法必须简单有效，发育成胚泡的比例高，且胚泡的形态和质量好[5]。孤雌激活不充分或培育条件不恰当，都会影响孤雌胚胎的发育潜力。目前，激活方法主要有两类:物理方法和化学方法。前者包括机械、温度以及电刺激，后者包括酶刺激、高渗或低渗环境、离子处理和蛋白合成抑制剂处理等。

卵母细胞成熟后,一直静止在第二次减数分裂的中期。此时，卵母细胞的胞质中含有持续高水平的中期促进因子（MPF）和细胞静止因子（CSF）。当卵母细胞在正常的受精过程中受到精子的激活时，其胞质的Ca2+浓度在一定时限内呈脉冲式升高，进而破坏贮存和新合成的CSF，导致MPF失活、减数分裂恢复、排出第二极体，促进原核形成、卵裂和早期胚胎发育。因此，卵母细胞激活过程中，细胞内Ca2+节律性脉冲升高起着关键性的介导作用。A23187可直接触发Ca2+内流，达到激活目的[7]。6-DMAP是蛋白质磷酸化抑制剂,能阻止p34蛋白上的第161位酪氨酸磷酸化，导致MPF失活，促进卵母细胞减数分裂的恢复；还能抑制卵母细胞第二极体的排出，诱发卵母细胞形成一个二倍体的单原核，实现孤雌发育的目的[8]。本研究用A23187和6-DMAP激活卵母细胞，得到了88.46%的激活率和40.58%的囊胚形成率。

孤雌胚胎干细胞系建立后，最主要的是确定其是否真正来源于未受精的卵母细胞。在不同个体之间及同一个体的正常组织与某些异常组织之间，微卫星位点的重复单位数目不同，具有丰富的多态性，是目前在在小鼠遗传监测方面常用的一种方法。经微卫星技术检测，我们建立的细胞株为孤雌来源。结合细胞表面标志物、核型分析、和致畸胎瘤实验的结果，可以判断该细胞株具有胚胎干细胞特性。

PGES具有和正常受精囊胚来源的ESCs一样的生物学特征，可以在体外无限增殖，保持未分化状态。但是哺乳动物孤雌胚胎来源的干细胞由于缺乏父源性印记基因，分化能力较正常受精卵来源的ESCs差。目前，对于孤雌胚胎干细胞向3个胚层分化的能力看法不一。Newman-Smith等[9]发现，来自鼠孤雌胚胎的ICM在增殖和分化方面存在缺陷。由于缺乏胰岛素样生长因子-1受体和胰岛素样生长因子-2的基因表达产物，源自孤雌胚胎的ICM不能保持未分化的干细胞状态，且几乎分化为独有的体壁内胚层细胞。有研究证实，孤雌胚胎干细胞的分化潜能主要是在向内胚层和中胚层分化时受到限制。以往我们也发现，在体外的诱导分化实验中，可以在短期内诱导出大量的神经前体细胞[10]。与此一致，本次体内分化实验显示，在形成的畸胎瘤团块中，外胚层组织所占的比例最大。

总之，孤雌激活胚胎干细胞系的建立，为胚胎干细胞的应用提供了更广阔的前景，但是由于缺乏父源性基因印记，在分化潜能及定向诱导方面还需进一步研究。

[1]Lin H,Lei J,Wininger D,etal.Multilineage potentialofhomozygous stem cellsderived frommetaphaseⅡoocytes[J].Stem Cells,2003, 21(2):152-161.

[2]Karagenc L,Yalcin E,Ulug U,et al.Administration of increasing amountsofgonadotrophin compromisespreimplantation development ofparthenogeneticmouseembryos[J].Reprod Biomed Online,2004,8 (6):628-634.

[3]Hiypp J,Atala A.Tissue engineering,stem cells,cloning and parthenogenesis:new paradigms for therapy[J].JExp Clin Assist Reprod,2004,1(1):3.

[4]Sengoku K,Takuma N,Miyamato T,et al.Nuclear dynamics of parthenogenesis of human oocytes:effect of oocyte aging in vitro [J].Gynecol Obstet Invest,2004,58(3):155-159.

[5]Mizutani E,Jiang JY,Mizuno S,et al.Determination of optimal conditions for parthenogenetic activation and subsequent development of rat oocytes in vitro[J].JReprod Dev,2004,50(1):139-146.

[6]Pivko J,Landa V,Kubovicova E,et al.Comparativemorphometry of precompacted bovine embryos produced in vivo or in vitro after parthenogenetic activation and intracytoplasmic sperm injection (ICSI):ultrastructural analysis[J].Zygote,2003,11(3):207-217.

[7]舒益民,庄广伦,周灿权.Ca2+载体A23187对受精失败人类成熟卵母细胞的补救激活作用[J].中国病理生理杂志,2003,19(2): 260-262.

[8]舒益民,庄广伦,周灿权.应用钙离子载体A23187及6-甲基嘌呤对人卵母细胞进行孤雌激活[J].生殖医学杂志,2002,11(3): 145-148.

[9]Newman-Smith ED,Werb Z.Stem cell defects in parthenogenetic peri-implantation embryos[J].Development,1995,121(7):2069-2077.

[10]韦多,王彦,高选,等.小鼠孤雌胚胎干细胞直接向神经细胞诱导分化的实验研究[J].山东大学学报医学版,2008,46(5):445-448.

Creation of a M ouse Parthenogenetic Stem Cell Line

W ANG Yan1,QIAN Dejian1,WEIDuo2,XU Kai2,HUAN Qing2, LU Hong2,GAO Xuan2,CHEN Zijiang2.
1 Qianfoshan Hospital of Shandong Province,Ji′nan 250014,China;2 Center for Reproductive Medicine,Shandong Provincial Hospital Affiliated to Shandong University,Ji′nan 250021,China.Corresponding author:CHEN Zijiang.

ObjectiveTo creat a mouse parthenogenetic stem cell line by chemical activation.M ethodsMouse oocyteswere treated with A23187 and 6-DMAP,and then cultured till blastula embryos formed.Then the inner cellmass (ICM)cells were isolated,cultured,and passaged.Cells of the 37thpassage were examined by karyotyping to analyze chromosomes,microsatellite technique to determine homozygous genotype,immunohistochemistry to detect expression of specific cellmarkers,and teratogenic test to exhibitmulti-lineage potency.ResultsThe cells had a homozygous genotype and normal karyotype.The cellswere positive for alkaline phosphatase,Oct-4,and SSEA-1,and negative for SSEA-4.After injected into the SCID mice,the cells differentiated into three germ layers,and formed teratoma at the injection site.ConclusionAn embryonic stem cell line can be created by A23187 and 6-DMAP activation ofmouse oocytes.

Parthenogenetic;Embryonic stem cells;A23187;6-DMAP

book=132,ebook=13

Q813.1+1

A

1673－0364（2010）03－0132－04

10.3969/j.issn.1673-0364.2010.03.003

2010年2月28日；

2010年4月19日)

250014山东省济南市山东省千佛山医院（王彦，钱德俭）；250021山东省济南市山东大学附属山东省立医院生殖医学中心（韦多，徐凯，宦晴，吕鸿，高选，陈子江）。

陈子江。