软骨源性形态发生蛋白-1的研究进展

赵亮 汤译博 苏佳灿

软骨源性形态发生蛋白-1的研究进展

赵亮 汤译博 苏佳灿

1994年，Storm等[1]发现了生长分化因子-5（Growth/Differentiation Factor-5，GDF-5）；同年，Chang等[2]克隆出一种名为软骨源性形态发生蛋白-1（Cartilage-derived morphogenetic protein-l，CDMP-1）的多肽，并证实两者是同一种蛋白因子。CDMP-1是骨形态发生蛋白（BMP）家族中的新亚型，作用于骨骼系统，具有多种调节功能，特别是能促进软骨形成和发育，可以用于软骨、骨、关节、肌腱、韧带、椎间盘等的治疗。本文就CDMP-1的研究进展进行综述。

1 CDMP-1的分子结构

CDMP-1的编码基因最早由Hotten等[3]从人胚胎cDNA库中克隆获得，定位于20q11.2染色体，全长488 kb。与BMP家族其他因子一样，CDMP-1也是由分子间二硫键连接的同型二聚体（图1），共含有501个氨基酸，由位于N端的信号肽、中间的前体肽以及C端的成熟肽构成[4]。其中，前区由376个氨基酸组成，肽链蛋白水解位置和120个氨基酸组成的C-末端区中含有7个TGF-β家族成员所特有的保守半胱氨酸残基团[5]。前体蛋白裂解为成熟肽后，N端肽链延长，蛋白异型化，从而改变了CDMP-1的分布，使得骨关节处CDMP-1的含量增加，进而发挥其诱导软骨生成的特殊生物学作用[6]。

图1 CDMP-1的分子结构

2 CDMP-1的生物学作用

2.1 促进软骨及骨的发育

CDMP-1主要表达于四肢骨肢端、关节区、胚胎发育期骨骼前体及其周围、软骨母细胞聚集区及形成软骨前体的组织周围，是四肢骨发育（尤其是早期软骨化阶段）的重要调节因子。在软骨发育早期，CDMP-1以剂量依赖的方式促进软骨祖细胞在一定部位聚集、黏附，在软骨发育晚期则刺激软骨细胞的肥大、增生和成熟[7]。Takahara等[8]在研究CDMP-1缺失的鼠模型时发现，其趾骨在发育过程中出现间充质细胞（前软骨细胞）的凋亡以及干细胞聚集、分化等的延迟，认为CDMP-1促进了趾骨发育。Francis-West等[9]利用逆转录病毒载体，使CDMP-1过度表达，增加了鸡肢芽的宽度和长度。最初认为直接原因是软骨细胞数量的增多；进一步观察发现，用外源CDMP-1刺激软骨发育初期的间充质细胞，可以显著促进细胞聚集和软骨分化，但并不增加细胞的数量；而用脉冲标记实验监测转染CDMP-1基因的软骨祖细胞软骨发育后期的作用，结果表明CDMP-1明显促进了软骨细胞的增殖。作为一种生物信号，CDMP-1受到BMP家族其他成员的调节，控制鸡胚肢芽中趾骺区软骨的发育[10]；并与其他多种信号分子一起，促进胎儿出生后关节软骨细胞和肢体软骨源性细胞合成蛋白聚糖[11]。此外，CDMP-1还存在于成年牛和人的关节软骨中，参与正常软骨表型的维持以及病变组织的再生反应[12]。

2.2 诱导分化为软骨及骨

CDMP-1是一种多肽生长因子，具有特异的软骨诱导能力，可在异位诱导软骨形成。大量实验证实，CDMP-1能在体外诱导骨间充质细胞、骨膜源性细胞等，形成软骨样结构。Spiro等[13]将含有0.01mg/m L和0.1mg/m L两种浓度rhCDMP-1的Ⅰ型骨胶原/羟基磷灰石载体植入SD大鼠的皮下以及胫骨后肌内，2周后发现皮下和肌肉内碱性磷酸酶的活性随rhCDMP-1浓度的增高而增加，提示在这些部位异位诱导了软骨和骨的生成。该实验还证实，在胶原或HA存在的条件下，CDMP-1可诱导体外培养的胎鼠颅顶细胞形成软骨结节。Kakudo等[14]将含有不同浓度CDMP-1（0μg、100μg、300μg、500μg）的Ⅰ型胶原植入24只Wistar鼠的腓肠肌内，3周后进行X射线及组织学分析，发现0μg组和100μg浓度组没有生成软骨组织，而300μg浓度组有大量软骨组织积聚以及部分骨形成，而500μg组形成了骨小梁和骨髓，不含任何软骨成分。吕学敏等[15]用重组人CDMP-1干预体外培养的鼠肢芽细胞微团，发现100mg/mL的CDMP-1促软骨化作用最强，另外特定浓度的CDMP-1可促进肢芽细胞的增殖，提示在肢体形成阶段，CDMP-1在体内可能通过调控细胞增殖和软骨分化来实现对骨骼系统发育的调节。Gruber等[16]在骨膜源性细胞的诱导分化研究中发现，体外培养软骨组织时添加最优浓度的CDMP-1、CDMP-2，并没有出现多糖合成的协同增加作用；CDMP-l浓度为100 ng/mL时，可达到最大的生物学效能，继续提高CDMP-1浓度并不会增强促基质合成的作用。上述实验均表明，CDMP-1的促软骨分化作用有剂量依赖性，并存在效应阈值。

TGF-β是软骨形成过程中的必需调节因子，在胚胎发育期有较高的表达，是体外诱导骨髓基质细胞（BMSCs）软骨化研究的重点对象。但有研究显示，在无血清培养基中单独使用小剂量TGF-β，并不能促进BMSCs向软骨细胞转化；而在联合使用BMP-6、胰岛素样生长因子(IGF)-l等其他因子后，Ⅱ型胶原表达和糖胺聚糖（GAG）含量增加，表现出明显的软骨化效应。研究表明，高剂量的CDMP-1与TGF-β一样，可促进BMSCs的软骨化，两者联合使用能协同促进BMSCs的增殖和软骨化[17]。尹烁等[18]证实，用CDMP-1诱导人真皮成纤维细胞，所得细胞能向软骨细胞表型分化，并能分泌软骨细胞特异性基质，通过CD49介导的细胞与细胞、细胞与基质之间的相互作用，有助于维持人真皮成纤维细胞软骨化后的表型。

2.3 对肌腱/韧带、椎间盘的作用

2.3.1 修复肌腱、韧带损伤

研究表明，CDMP-1还存在于肌腱细胞和韧带细胞中，对两种组织的发育起到相同的促进作用。Chhabra等[19]发现，CDMP-1缺失的小鼠肌腱损伤后，细胞GAG和胶原浓度需要更长时间才能达到峰值，胶原原纤维改变的时间延迟，血管形成时间延迟近l周。这提示CDMP-l在细胞聚集、迁移、分化、增殖和血管形成中起重要作用，CDMP-l的缺失可导致肌腱愈合延迟。Forslund等[20]发现，CDMP-1、2、3在改善肌腱、韧带修复以及骨合成方面表现相似。Bolt等[21]用腺病毒载体将CDMP-1转染至SD大鼠，治疗Achilles肌腱撕裂的部位，2周后组织学和生物化学分析显示，转导了CDMP-1的肌腱裂隙最小，肌腱修复后被拉长70%。Dines等[22]以rhGDF-5治疗肌腱损伤，发现受损肌腱明显肥大，愈合率显著升高。

2.3.2 修复椎间盘退变

椎间盘细胞是一种软骨样或纤维软骨样细胞，在大小、分布和ECM方面与关节软骨细胞类似。由于CDMP-1能够促进悬浮培养的软骨细胞增殖，提示可通过CDMP-1来提高活性细胞的数量，进而修复退行性椎间盘病变（Degeneration disc disease，DDD）。Wang等[23]用腺病毒载体将CDMP-1及TGF-β分别转染到兔和人椎间盘细胞中，发现过量表达的CDMP-1及TGF-β可以促进椎间盘细胞的增殖以及髓核、纤维环细胞的生长。Li等[24]发现，CDMP-1基因敲除小鼠的椎间盘内纤维结构排列紊乱，纤维软骨成分替代了正常的纤维环，Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原及蛋白聚糖基因表达下降。用不同浓度的重组人CDMP-1体外培养该小鼠椎间盘细胞20周后，蛋白聚糖合成以及Ⅰ、Ⅱ型胶原基因的表达随CDMP-1剂量增大而增加。Walsh等[25]研究鼠椎间盘压力退变模型发现，将CDMP-1注入退变的活体鼠尾椎间盘内，内侧纤维环的软骨细胞可迁入髓核中，并活跃表达蛋白聚糖和Ⅱ型胶原。Chujo等[26]研究兔第2腰椎间盘穿刺退变模型发现，注射重组人CDMP-1能促进椎间隙恢复，增加MRI评分。Maitre等[27]的研究同样证实了CDMP-1可促进人退行椎间盘中蛋白聚糖的合成以及细胞间质的修复。由此可见，椎间盘内单一注射重组人CDMP-1，能够修复退变椎间盘。

2.4 其他作用

CDMP-1对神经系统具有营养和保护作用。早期研究表明，CDMP-1可以显著减轻羟基多巴胺对小鼠黑质体多巴胺能神经元的损害。Aideen等[28]发现，CDMP-1可以保护中脑多巴胺能神经元，并促进其神经传导功能，提示CDMP-1可用于帕金森氏症等神经退化性疾病的治疗。Zeng等[29]则发现，CDMP-1不但可以诱导小鼠骨分化，还可以通过增加血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）的表达以促进小鼠间质细胞生成血管。

CDMP-1还能调节牙胚发育、刺激牙龈韧带细胞增殖和基质代谢。Sumita等[30]发现，在牙的生成过程中，CDMP-1可以联合BMP-2等生长因子，促进牙乳头及滤泡的分化。最新研究表明，心肌梗死的WT小鼠模型中，心脏的CDMP-1含量明显升高，梗死灶周围心肌细胞和成肌纤维细胞的表达也增加，提示CDMP-1在心肌梗死后的心脏修复中发挥一定作用[31]。

3 CDMP-1的作用机制

人们对CDMP-1作用的受体机制研究较为深入（图2）[32]。目前已知Sox9转录因子是软骨发生的基础，而Runx2转录因子是骨发生的基础。CDMP-1可以诱导间充质干细胞表面BMP IB型受体（即ALK-6受体）的低聚以及ⅡB型受体的活化，从而导致Smad蛋白磷酸化。磷酸化的Smad蛋白进入细胞核，直接结合DNA或间接结合其他蛋白，从而调控Sox9和Runx2的表达，诱导前成骨细胞以及分泌性成骨细胞的分化，同时还可以促进碱性磷酸酶（ALP）等成骨相关蛋白的表达[33]。最新研究表明，CDMP-1和BMP2一样，可以通过活化BMPR2来稳定XIAP，以抑制细胞凋亡、促进生长[34]。Liu等[35]发现，在人风湿性成纤维样滑膜细胞中，CDMP-1可以被IL-1β抑制，促进TGF-β3介导的软骨分化。

图2 CDMP-1作用的受体机制

关于CDMP-1的信号通路，目前研究尚不充分。已知CDMP-1可以通过p38 MAPK通路来传导信号，上调ALP、骨涎蛋白以及骨桥蛋白等的表达，而这些蛋白均与前成骨细胞以及分泌性成骨细胞的表型有关[36]。已有研究表明，活化的CDMP-1可以通过p38 MAPK通路促进软骨形成，而对骨形成的促进作用还需进一步研究。此外，CDMP-1的生物作用除了与其特异性受体结合关系密切外，还受到细胞外基质的影响，细胞外基质和CDMP-1因子的恰当复合是获得良好的组织修复效果的关键。

4 问题与展望

CDMP-1具有多方面的生物学作用，在临床治疗上具有广阔的应用前景。然而，CDMP-1的生物学作用机制，尤其是信号机制，仍然不完全清楚。CDMP-1在软骨发育过程、骨折愈合和肌腱修复等方面的作用机制和临床应用，CDMP-1与愈合环境之间的相互作用，以及生长因子对修复细胞分化调控机制等问题，均有待进一步研究和解决。目前，骨髓间充质干细胞（BMSCs）是组织工程研究领域中的重要种子细胞，关于其诱导分化的机制，一直是组织工程学领域的研究热点。然而有关CDMP-1对BMSCs刺激诱导作用的报道很少，今后应进一步探讨其对BMSCs增殖分化的调节作用以及作用机制。相信随着以上问题的逐步解决及组织工程技术的不断改进，CDMP-1会用于更多疾病的治疗和预防。

[1]Storm EE,Huynh TV,Copeland NG,et al.Limb alterations in brachypodism mice due to mutations in a new member of the TGF-beta superfamily[J].Nature,1994,368(6472):639-643.

[2]ChangSC,HoangB,Thomas JT,etal.Cartilage-derivedmorphogenetic proteins.New members of the transforming growth factor-beta superfamily predominantly expressed in long bones during human embryonic development[J].JBiolChem,1994,269(45):28227-28234.

[3]Hotten G,NeidhardtH,Jacobowsky B,etal.Cloning and expression of recombinant human growth/differentiation factor 5[J].Biochem Biophys Res Commun,1994,204(2):646-652.

[4]Luyten FP.Cartilage-derived morphogenetic protein-1[J].Int J Biochem Cell Biol,1997,29(11):1241-1244.

[5]Nickel J,Kotzsch A,Sebald W,et a1.A single residue of GDF-5 defines binding specificity to BMP receptor IB[J].JMol Biol, 2005,349(5):933-947.

[6]Fujimura K,TeraiY,Ishiguro N,etal.Heterotypy in the N-terminal region of growth/differentiation factor 5(GDF5)mature protein during teleost evolution[J].Mol Biol Evol,2008,25(5):797-800.

[7]Coleman CM,Tuan RS.Functional role of growth/differentiation factor 5 in chondrogenesis of limb mesenchymal cells[J].Mech Dev,2003,120(7):823-836.

[8]Takahara M,Harada M,Guan D,et a1.Developmental failure of phalanges in the absence of growth/differentiation factor 5[J]. Bone,2004,35(5):l069-l076.

[9]Francis-West PH,Robson L,Evans DJ.Craniofacial development: the tissue and molecular interactions that control development of the head[J].Adv Anat Embryol Cell Biol,2003,169(4):1-138.

[10]Gonzalez J,Tamayo E,Merino R,et al.CD4+CD25+T celldependentinhibitionofautoimmunity in transgenicmiceoverexpressing human Bcl-2 in T lymphocytes[J].JImmunol,2007,178(5):2778-2786.

[11]PacificiM,Koyama E,Shibukawa Y,et al.Cellular andmolecular mechanisms of synovial joint and articular cartilage formation[J]. Ann N Y Acad Sci,2006,1068:74-86.

[12]Pradhan D,Sharon M,Kumer M,et al.Synthesis of beaded and entwined carbon nanofibers in Ni:Al alloy catalyst[J].JNanosci Nanotechnol,2007,7(3):1034-1038.

[13]Spiro RC,Liu L,Heidaran MA,et al.Inductive activity of recombinanthuman growth and differentiation factor-5[J].Biochem Soc Trans,2000,28(4):362-368.

[14]Kakudo N,Wang YB,Miyake S,et al.Analysis of osteochondroinduction using growth and differentiation factor-5 in ratmuscle [J].Life Sci,2007,81(2):137-143.

[15]吕学敏,邓廉夫,杨庆铭.GDF-5在小鼠肢体骨骼发育中的表达及对肢芽细胞影响的研究[J].中国矫形外科杂志,2004,12(7): 521-523.

[16]Gruber R,Mayer C,Bodacz K,et al.Effects of cartilage-derived morphogenetic proteinsand osteogenic protein-1 on osteochondrogenic differentiation of periosteum-derived cells[J].Endocrinology,2001, 142(5):2087-2094.

[17]Song YH,GebmertS,SadatS,etal.VEGF is critical for spontaneous differentiation ofstem cells into cardiomyocytes[J].Biochem Biophys Res Commun,2007,354(4):999-1003.

[18]Yin S,Cen L,Wang C,etal.Chondrogenic transdifferentiation of human dermal fibroblasts stimulated with cartilage-derived morphogenetic protein 1[J].Tissue Eng Part A,2010,16(5):1633-1643.

[19]Chhabra A,Tsou D,Clark RT,et a1.GDF-5 deficiency in mice delaysAchilles tendon healing[J].JOrthop Res,2003,21(5):826-835.

[20]Forslund C,Rueger D,Aspenberg P.A comparative dose-response study of cartilage-derived morphogenetic protein(CDMP)-1,-2 and-3 for tendon healing in rats[J].JOrthop Res,2003,21(4): 617-621.

[21]Bolt P,Clerk AN,Luu HH,et al.BMP-14 gene therapy increases tendon tensile strength in a ratmodel of Achilles tendon injury [J].JBone Joint Surg Am,2007,89(6):1315-1320.

[22]Dines JS,Weber L,Razzano P,et al.The effect of growth differentiation factor-5-coated sutures on tendon repair in a rat model[J].JShoulder Elbow Surg,2007,16(5 Suppl):S215-S221.

[23]Wang H,Kroeber M,Hanke M,et al.Release of active and depot GDF-5 after adenovirus-mediated overexpression stimulates rabbit and human intervertebral disc cells[J].JMol Med,2004,82(2): 1262-1341.

[24]Li X,Leo BM,Beck G,etal.Collagen and proteoglycan abnormalities in theGDF-5-deficientmiceandmolecular changeswhen treating disk cellswith recombinant growth factor[J].Spine,2004,29(20): 2229-2234.

[25]Walsh AJ,Bradford DS,Lotz JC.In vivo growth factor treatment of degenerated intervertebral discs[J].Spine,2004,29(2):156-163.

[26]Chujo T,An HS,Akeda K,et al.Effects of growth differentiation factor-5 on the intervertebral disc-in vitro bovine study and in vivo rabbit disc degeneration model study[J].Spine,2006,31(25): 2909-2917.

[27]Le Maitre CL,Freemont AJ,Hoyland JA.Expression of cartilage derived morphogenetic protein in human intervertebral discs and itseffectonmatrix synthesis in degenerate human nucleus pulposus cells[J].Arthritis Res Ther,2009,11(5):R137.

[28]Sullivan AM,O'Keeffe GW.The role of growth/differentiation factor 5(GDF5)in the induction and survival ofmidbrain dopaminergic neurones:relevance to Parkinson's disease treatment[J].JAnat, 2005,207(3):219-226.

[29]Zeng Q,Li X,Beck G,et al.Growth and differentiation factor-5 (GDF-5)stimulatesosteogenic differentiation and increases vascular endothelial growth factor(VEGF)levels in fat-derived stromal cells in vitro[J].Bone,2007,40(2):374-381.

[30]Sumita Y,Honda MJ,Ueda M,et al.Differential effects of growth differentiation factor-5 on porcine dental papilla-and folliclederived cells[J].Growth Factors,2010,28(1):56-65.

[31]Zaidi SH,Huang Q,Momen A,et al.Growth differentiation factor 5 regulates cardiac repair aftermyocardial infarction[J].JAm Coll Cardiol,2010,55(2):135-143.

[32]Moore YR,Dickinson DP,Wikesjo UM.Growth/differentiation factor-5:a candidate therapeutic agent for periodontal regeneration? A review of pre-clinical data[J].JClin Periodontol,2010,37(3): 288-298.

[33]Polimeni G,Susin C,Wikesjo UM.Regenerative potential and healingdynamicsof theperiodontium:a critical-size supra-alveolar periodontaldefectstudy[J].JClin Periodontol,2009,36(3):258-264.

[34]Liu Z,Shen J,Pu K,etal.GDF5 and BMP2 inhibitapoptosis via activation of BMPR2 and subsequent stabilization of XIAP[J]. Biochim Biophys Acta,2009,1793(12):1819-1827.

[35]Liu FL,Lin LH,Sytwu HK,et al.GDF-5 is suppressed by IL-1 betaand enhances TGF-beta3-mediated chondrogenic differentiation in human rheumatoid fibroblast-like synoviocytes[J].Exp Mol Pathol,2010,88(1):163-170.

[36]Bessa PC,Cerqueira MT,Rada T,et al.Expression,purification and osteogenic bioactivity of recombinanthuman BMP-4,-9,-10, -11 and-14[J].Protein Expr and Purif,2009,63(2):89-94.

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A

1673－0364（2010）03－0171－04

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2010年1月9日；

2010年2月26日)

200433上海市第二军医大学附属长海医院骨科。

苏佳灿。