大鼠力竭游泳运动外周血内mi-422a与大脑皮质Bcl-w表达与运动性中枢疲劳

杨 立

(西北民族大学体育学院,甘肃 兰州 730030)

大鼠力竭游泳运动外周血内mi-422a与大脑皮质Bcl-w表达与运动性中枢疲劳

杨 立

(西北民族大学体育学院,甘肃 兰州 730030)

研究目的:探讨外周血内Mir-422a可否监测运动性中枢疲劳。研究方法:健康雄性W ister大鼠 36只,随机分为对照组(C组)、一次性力竭运动组 (E组)。力竭运动后即刻、12h和 24h取各组外周血和大脑皮质分别采用 real-time PCR和免疫组织化学技术检测各组外周血Mir-422a和大脑皮质Bcl-w表达。结果:力竭运动后即刻Mir-422a表达降低 (P<0.05),而Bcl-w表达升高 (P<0.05);12h后Mir-422a表达逐渐升高,而Bcl-w表达逐渐降低,24h均基本恢复到安静水平。结论:外周血内Mir-

422a的表达有望成为运动性中枢疲劳的监测指标。

运动性中枢疲劳;力竭游泳运动;Mir-422a;bcl-w

MicroRNA(miRNA)是一类长度为 18-25个核苷酸左右的内源性非编码小 RAN。miRNA在进化上高度保守,具有转录后基因调控功能。近年,越来越多的动物实验证实 miRNA存在组织特异性[1-4]。不同的疾病或亚临床状态对应不同的MiRNA的改变,且此差异存在于外周血内[5]。2008年,文全庆[6]等人采用基因芯片技术检测大鼠脑缺血急性脑组织中MiRNA的表达变化发现:缺血缺氧条件下可以导致细胞内miRNA的变化,主要集中在细胞凋亡基因、细胞周期基因和血管内皮生长因子基因三个方面。大量研究证实凋亡相关因子在脑缺血再灌注损伤过程中发挥重要作用,最近医学研究发现 Mir-422a(microRNA-

422a)是凋亡发生的调控基因[7]。

本研究旨在通过大鼠一次性力竭游泳运动模型,动态观察力竭运动后外周血内Mir-422a的表达变化和大脑皮质内Bcl-w的表达变化,探讨外周血内Mir -422a可否预警运动性中枢疲劳,为运动性中枢疲劳的监测提供实验支持。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选用健康雄性W ister大鼠 36只,体重 200±15g(由上海西普尔 -必凯实验动物有限公司提供)。大鼠常规分笼饲养,进食标准饲料,自由饮水。室温保持20-22℃,相对湿度 45-50%,光照时间为 12h/d。大鼠按体重分层,参照随机数字表分为两组:对照组 (C组,n=8)自由饮水进食,不受任何干预;一次性力竭运动组(E组,n=32)进行负自身体重 3%的一次性力竭游泳运动,E组又依据取材时间不同分为力竭后即刻取材 E0组、12h后取材 E12组和 24h后取材 E24组各 8只。力竭表现:鼻孔或大鼠整个没入水面一下 5 -10s不能主动上浮。

1.2 取材

E组即刻、12h和 24h腹腔注射 3ml/kg水合氯醛(10%)麻醉。心脏体外穿刺抗凝取血 1ml备用;断头取大脑皮质,置 4%的甲醛中固定备用。C组在力竭游泳前 1d取材。

1.3 MiRNA的提取与Mir-422a的检测

全血中MiRNA的提取试剂盒购自美国AB公司,英文名称为 Rat RiboPure(T M)-Blood Kit(AB code: AM1951)。反转录按照 FG,Taqman(r)microRNA RT Kit反转录试剂盒操作 (AB code:4369016)。Mir-422a引物试剂盒由 AB公司设计合成,内参选择 U6 (B)。相关耗材均购自美国 AB公司,所有操作均按照试剂盒说明进行操作。

1.4 免疫组织化学测定Bcl-x

Bcl-x抗体购自北京中山生物科技有限公司,具体操作步骤参照试剂盒说明书进行。观察大鼠大脑皮质Bcl-x的积分光密度值。

1.5 统计学方法

数据处理采用 SPSS 13.0,实验数据用 mean±SD表示,样本均数做 t检验检测,P<0.05认为有显著性差异。

2 实验结果

2.1 MiRNA的表达

本研究采用美国AB公司 TaqMan MiRNA分析技术,由扩增曲线可以得知,产物特异性好(如图 1)。各组的 CT值经 U6 MiRNA标注化后结果如图 2所示。实验采用 15μl的反应体系进行反转录,反应条件为16℃×30min,42℃×30min,85℃×5min,然后 4℃× 30min。PCR的反应条件为 95℃×10min,然后 40个循环的 95℃×15sec,60℃×60sec。Mir-422a的表达为运动后即刻降低 (P<0.05),此后逐渐升高,24h后基本回复到安静水平。

2.2 Bcl-w的表达

我们采用了免疫组织化学的方法检测了大鼠大脑皮质内Bcl-w的表达,由 Bcl-w的积分光密度值可知,Bcl-w的表达变化与Mir-422a的表达呈负相关,力竭后即刻达峰,此后逐渐下降,24h后基本恢复到安静水平(图 3)。

图 3 大脑皮质内Bcl-w表达的积分光密度值

3 分析与讨论

运动性疲劳是造成运动员机能下降的重要因素,也是运动员伤病产生的主要原因,它制约着运动员竞技能力的提高。林俊峰[8]选取血尿素、血睾酮、皮质醇等指标对武术运动员的运动性疲劳进行实验研究,研究发现血尿酸和皮质醇主要是反映机体分解代谢功能的指标,而血睾酮为反映机体合成代谢功能指标,且均为反映外周疲劳的指标。此外,其它关于运动性疲劳的监测方面的研究也主要集中在外周疲劳的研究[9]。根据运动性疲劳发生的顺序来看,首先发生的是运动性中枢疲劳,因此寻找中枢疲劳的监测指标,合理安排运动量,科学训练,减少伤病的发生是运动人体科学界亟待解决的问题。

MicroRNA(MiRNA)是一类小型非编码 RNA,分布于多种动植物中。多数MiRNA的基因结构和功能呈现进化保守性,通过与mRNA内特定把序列互补配对,在转录后或翻译 2个水平上调控基因的表达[10],实现对细胞增殖分化、细胞凋亡、新陈代谢、以及病理过程的调节[11]。MiRNA在生物发育的不同阶段、细胞和组织中表达的类型不同[12],且血清中的 miRNA不会被 RNase降解,极端情况下,血清中的miRNA仍有极好的稳定性;且只有种系差异无个体差异,而且在血清和血浆中,同一种miRNA的检测结果具有良好相关性,说明外周血miRNA具有良好的生物标记检测的潜质。

Bcl-w蛋白是抗凋亡 bcl-2家族中的成员,大量研究发现microRNA在神经系统缺血再灌注损伤诱导的凋亡中起到一定的的作用[13]。李朝晖研究发现, microRNA-422a参与了凋亡过程,且可能通过调节bcl-w蛋白的表达来发挥促凋亡的作用,且两者呈负相关。力竭运动过程中同样存在运动性脑缺血,在恢复阶段又存在再灌注,运动人体科学界将此现象称作运动性脑缺血再灌注。本实验同样发现,大脑皮质内Bcl-w的表达与外周血内Mir-422a呈现负相关,即力竭运动后即刻Mir-422a表达降低 (P<0.05),而Bcl-w表达升高 (P<0.05);12h后Mir-422a表达逐渐升高,而Bcl-w表达逐渐降低,24h基本恢复到安静水平。因此,我们推测,Mir-422a可能参与了运动性脑缺血再灌注诱导的凋亡。

4 结论

细胞凋亡是运动性中枢疲劳的发生机制之一,外周血内Mir-422a的表达有望作为运动性中枢疲劳的监测指标。

[1]Esquela-Kerscher A,Slack FJ.Oncomirs-microRNAs with a role in cancer[J].Nat Rev Can.2006(6):259-269.

[2]Stefani G,Slack FJ.Small non-conding RNAs in animal development[J].NatRevMolCellBiol.2008,9(3):219-230.

[3]Chin LJ,Slack FJ.A truth serum for cancer-microRNAs have major potential as cancer biomarkers[J].Cell Res.2008, 18:983-984.

[4]Wang QZ,Xu W,Habib N,Xu R. Potential uses of microRNA in lung cancer diagnosis,prognosis,and therapy[J]. Curr CancerDrug Targets.2009,9(4):572-694.

[5]Gilad S,Meiri E,Yogev Y,et al.Serum microRNAs are promising novel biomarkers[J].PLoSONE.2008,3(9),1-7.

[6]文全庆,贾延劼,王明闯等.大鼠脑缺血急性期脑组织miRNA的表达变化[J].重庆医科大学学报,2008,33:23-26.

[7]李朝晖,李天题,王芬等.H2O2诱导 PC12细胞凋亡中MicroRNA表达及 bcl-w调控机制[J].中山大学学报 (医学科学版).2009,30(4s):34-40.

[8]林俊峰.武术运动员的运动性疲劳监测与恢复研究[J].商丘师范学院学报.2009,25(9):123-127.

[9]王雪冰,冯连世.肌乳酸、细胞内 pH值与运动性疲劳研究进展[J].中国运动医学杂志.2009,28(1):109-111.

[10]Borchert G M,LanierW,Davidson BL.RNA polymerase III transcribes humanMicroRNAs[J].Nat St ructMolBiol.2006,13 (12):1097-1101.

[11]K im J,Krichevsky A,Grad Y. Identification of many microRNAs that copurifywith polyribosomes in mammalian neurons [J].Proc NatlAcad SciUSA.2004,101(1):360-365.

[12]Chen CZ.MicroRNAs as oncogenes and tumor suppressors [J].N Engl J Med.2005,353(17):1768-1771.

[13]Niwa Y,Hirose K,Nakanishi T,et al.Association of the NAD(P)H:quinine oxidoreductase C609T polymorphis m and the risk of cervical cancer in Japanese subjects[J].Gynecol Oncol. 2005,96(2):423-439.

The Relationship Between the Expression ofM ir-422a in Peripheral Blood
and Bcl-w in Cerebral Cortex and Exercise-Induced Central Fatigue

Yang L i

(College of Physical Education,NorthwestUniversity forNationalities,Lanzhou 730030)

Objective:To explore whetherMir-422a can monitor exercise-induced central fatigue.Methods:36 healthymaleW ister rats are randomly divided into the control group(group C)and the exhaustive group(group E). The expression of Mir-422a in peripheral blood and Bcl-w in cerebral cortex is tested by real-time PCR and immunohistochemistry immediately,12 hours and 24 hours after the exhaustive exercise.Results:The expression ofMir -422a dropswhile the expression ofBcl-w jumps immediately after the exercise(P<0.05);the expression ofMir-

422a gradually increaseswhile the expression ofBcl-w gradually decreases 12 hours after the exercise;the expression of the two both regain the previous level 24 hours after the exercise.Conclusion:The expression ofMir-422a in the peripheral blood is likely to be the index to monitor exercise-induced central fatigue.

exercise-induced fatigue,exhaustive s wimming,Mir-422a,Bcl-w

G804.2

A

1001—9154(2010)09—0069—03

book=69,ebook=148

G804.2

A

1001—9154(2010)09—0069—03

杨立:(1969—)内蒙古阿拉善左旗人,硕士,副教授,研究方向:足球教学及运动性疲劳相关研究。

2010—07—13