大鼠骨骼肌静力性负荷所致损伤过程中肌细胞能量代谢的变化

陈晓光,刘 晔

(1.河南师范大学体育学院,河南 新乡 453007;2.北京体育大学运动解剖学教研室,北京 100084)

大鼠骨骼肌静力性负荷所致损伤过程中肌细胞能量代谢的变化

陈晓光1,刘 晔2

(1.河南师范大学体育学院,河南 新乡 453007;2.北京体育大学运动解剖学教研室,北京 100084)

通过采用骨骼肌静力性负荷损伤动物模型,观察在所致损伤过程中肌糖原含量、骨骼肌线粒体ATP酶活性以及骨骼肌胞浆和血清中乳酸含量的变化,来探讨肌细胞能量代谢变化与骨骼肌静力性负荷所致损伤的关系。结果表明,肌细胞能源物质耗竭、能量供应不足以及糖类氧化不足所引起的三羧酸循环中介物缺乏并非导致骨骼肌静力性损伤的直接原因,肌细胞内乳酸等代谢产物堆积产生的毒副作用可能是引起骨骼肌静力性损伤的重要因素。

骨骼肌细胞;静力性损伤;能量代谢

目前对肌细胞内能量物质耗竭、合成障碍及代谢产物堆积是否会导致肌肉损伤存在较大争议,同时以往研究大多是针对离心性或向心性运动所致的骨骼肌损伤,而静力性运动所致的骨骼肌损伤研究较少,缺乏对其发生机制的深入探讨。本文通过骨骼肌静力性负荷所致损伤动物模型,从肌细胞能量代谢的角度对静力性负荷所致骨骼肌损伤的机制进行探讨,以期为大众健身、劳动卫生和运动训练领域提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物分组

健康纯系雄性 SD大鼠 72只(8周龄),体重221.8 ±4.7g,随机分成对照组(CON)、4周实验组(4WE)、3周实验组 (3WE)、2周实验组 (2WE)、1周实验组(1WE)和 3天实验组(3DE),每组 12只。适应 2天后分笼饲养,饲养环境温度为 22±2℃,相对湿度为 45-55%,自然光照,自由饮食、饮水。

1.2 骨骼肌静力性负荷所致损伤模型的制作

设计自制空心实验台,台上安装可调节高度的铁架。铁架横梁表面有用以固定大鼠前肢的光滑凹槽。在铁架下方台面钻 3个圆孔,2孔在前,相距 3cm,其连线距铁架横梁投影线后 5cm并与之平行,用于施加负荷的砝码通过而悬挂在大鼠踝关节上,同时起到固定大鼠后肢保持静力性运动的作用;另 1个孔在前面2孔连线中点后 2cm处,用于实验中容纳鼠尾,避免鼠尾支撑。

实验时将大鼠前肢固定在铁架横梁上,调节高度使其两侧后肢踝关节处于跖屈位支撑站立(以跖趾关节最大支撑不离开台面为标准),并在两侧踝关节处各施加 50%体重的负荷,每天上、下午各训练 1小时,分别训练 3天、1周、2周、3周和 4周。对照组不训练,其它条件与实验组相同。大鼠均在全部训练结束次日宰杀取材。

通过光镜、电镜切片和血清 CK、LDH检测证实,持续 3天至 4周后肢负重站立的静力性负荷诱发了大鼠腓肠肌发生损伤。

1.3 取材与指标测定

乙醚浅麻醉后,眼球取血,然后断头处死。血样以3000转/分转速离心 10分钟,分离血清。迅速取出右后肢腓肠肌,放入冷生理盐水中洗去浮血,剔除脂肪及结缔组织,用滤纸吸干。

称取腓肠肌 85毫克,采用南京建成生物工程研究所提供的肌糖原试剂盒和 721分光光度计测定肌糖原含量。

称取腓肠肌 2克,以差速离心法制备线粒体和胞浆[1]。采用南京建成生物工程研究所提供的 ATP酶试剂盒和 721分光光度计分别测定腓肠肌线粒体中Ca2+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶和 Na+-K+-ATP的活性。

采用南京建成生物工程研究所提供的乳酸 (LA)试剂盒和 721分光光度计分别测定腓肠肌胞浆和血清中乳酸含量。

1.4 数据统计处理

数据均以平均数 ±标准差(Mean±SD)表示,使用SPSS10.0统计软件进行处理,采用单因素方差分析进行各组间的差异显著性检验。显著性水平为 P﹤ 0.05。

2 实验结果

2.1 施加不同时间静力性负荷对肌糖原含量的影响

由表 1可见,施加 3天至 4周静力性负荷后,与对照组相比,各实验组大鼠肌糖原含量均下降,除 1周组无统计学差异外,其余各组均有显著性差异 (P<0.01或 P<0.05)。实验组间肌糖原含量的变化趋势表现为施加负荷 3天时已明显下降,较对照组降低 14.7% (P<0.05),1周时略有恢复 (P>0.05);2周时下降明显,与对照组、3天组和 1周组相比分别降低 37.8%、27.1%和 33.7%,均有极显著性差异 (P<0.01);3周时又明显回升,较 2周组升高 42.2%(P<0.01),但仍较对照组降低了 11.6%(P<0.05);至第 4周时急剧下降,较对照组降低 64.1%(P<0.01),较第 3周降低59%(P<0.01),与其余各组也有非常显著性差异 (P <0.01)。

表 1 施加不同时间静力性负荷后肌糖原与乳酸含量的变化

2.2 施加不同时间静力性负荷对腓肠肌胞浆乳酸含量的影响

由表 1可见,施加 3天至 4周静力性负荷后,各实验组大鼠骨骼肌胞浆乳酸含量均显著升高,与对照组相比均有极显著性差异(P<0.01)。其变化趋势表现为 3天至 1周时持续上升,分别较对照组升高了 20%和 27.3%。2周至 4周时骨骼肌胞浆乳酸增加更为明显,分别较对照组升高了 61.8%、85.4%和 58.2%,与3天、1周时相比亦均有显著性差异。3周时含量最高,至第 4周时略有回落,与 3周时相比具有显著性差异(P<0.05),但仍显著高于对照组、3天组和 1周组(P<0.01)。

2.3 施加不同时间静力性负荷对血清乳酸含量的影响

施加 3天至 4周静力性负荷后,各实验组大鼠血乳酸含量与对照组相比均显著升高 (P<0.01)。尽管各实验组间血乳酸含量的差异无统计学意义,但与骨骼肌胞浆乳酸一样,也表现出2至4周时高于3天至1周时的趋势(见表 1)。

2.4 施加不同时间静力性负荷对骨骼肌线粒体 ATP酶活性的影响

由表 2可见,施加 3天至 4周静力性负荷后,各实验组大鼠骨骼肌线粒体 Ca2+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶与Na+-K+-ATP酶活性与对照组相比均显著升高(P<0.01)。其变化趋势均表现为 3天和 1周时较为稳定,2至 4周时增加更为明显。

表 2 施加不同时间静力性负荷后线粒体ATP酶活性(μmolPi/mgProt/hour)的变化

3 分析与讨论

骨骼肌中的糖原经过有氧氧化或无氧酵解,释放能量合成ATP,是肌肉处于长时间收缩状态时的主要供能物质。以往很多研究均发现肌肉疲劳和损伤发生的同时伴随着肌糖原的耗竭。Entman[2]和 Friden[3]等的研究表明,肌糖原耗竭可导致 ATP含量下降,影响骨骼肌兴奋 -收缩耦联过程,并使肌原纤维蛋白的功能受损。Bergstrom等[4]认为在从中等到大负荷运动的过程中,肌糖原不仅是主要的能量来源,而且是必不可少的底物,因此它的大量减少将引起 ATP含量降低,导致疲劳甚至损伤。Sahlin等[5]的研究认为NADH的最大氧化和电子传递或脂肪氧化的维持均需一定水平的糖类氧化,如果糖类氧化不足,三羧酸循环中的中介物也将不足,最终导致肌肉疲劳和损伤。

但也有报道认为在长时间训练中肌糖原耗竭、低血糖及糖类氧化的降低并不是导致肌肉疲劳和损伤的主要因素。Coyle等[6,7]研究发现:即使血糖和糖类氧化率保持在正常水平时实验组依旧会发生疲劳。

本研究结果表明,在骨骼肌静力性负荷所致损伤过程中,大鼠肌糖原含量均下降,除 1周实验组外,其余各实验组与对照组均有显著性差异。同时各实验组骨骼肌胞浆乳酸和血乳酸含量均显著升高,并表现出

2-4周时高于 3天至 1周时的趋势。这表明大鼠进行静力性运动的过程中肌糖原作为能源物质直接参与了糖酵解供能,导致含量下降。这一结果排除了由于糖类氧化不足造成三羧酸循环的中介物不足而导致骨骼肌静力性损伤的可能性。

同时,本研究中在施加负荷的第 1周时,肌糖原含量与对照组相比并无显著性差异,施加负荷的第 3天、3周时也仅较对照组分别下降了 14.7%和 11.6%,下降幅度并不大,即使肌糖原含量降低较为明显的第 2周和第 4周,与对照组相比分别降低 37.8%和

64.1 %,也尚未达到耗竭的程度。这些结果说明,在骨骼肌静力性负荷所致损伤过程中,并未出现由肌糖原耗竭而导致ATP合成原料不足的现象,肌糖原含量的下降并不是导致骨骼肌静力性负荷所致损伤的直接原因。

许多研究表明,当肌肉长时间处于收缩状态时,由于各种途径导致的ATP合成障碍、含量降低是引起肌肉损伤的重要原因[8、9]。但也有学者认为肌肉疲劳和损伤与ATP的代谢并不相关。Saugen[10]等发现:在接近力竭时,肌肉产生肌张力的能力和代谢产物水平都没有发生很大的改变,即使是那些接近力竭的研究对象,仍可继续运动 15-20分钟而保持 ATP不下降。洪平等[11]使大鼠进行不同强度跑台运动至力竭,发现在 54m/min-66m/min高强度范围内 ATP含量较42m/min组显著性增加,并且较安静水平略有上升。这些结果均对肌肉力竭和损伤时存在“ATP危机”的观点提出质疑。

Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶和 Ca2+-Mg2+-ATP酶是细胞内各种生物膜上普遍存在的膜结合酶。它们在能量转换、物质运送等方面起着至关重要的作用。由于这些 ATP酶在发挥各自的功能时均有能量依赖性,必须水解 ATP释放能量,故当细胞内ATP缺乏时势必导致其活性的下降。因此细胞内ATP酶活性的改变可以反映细胞内 ATP含量的变化[12,13]。

在骨骼肌静力性负荷所致损伤过程中是否存在由于ATP合成障碍而导致其含量减少的可能呢?为此,本研究通过测定肌细胞线粒体内各种 ATP酶活性的变化,来间接反映ATP含量的改变,籍此对上述问题进行讨论。

本研究发现,施加 3天至 4周不同时间静力性负荷导致骨骼肌损伤时,大鼠骨骼肌线粒体 Ca2+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶和 Na+-K+-ATP酶活性与对照组相比均显著升高,表明ATP酶均处于较好的功能状态。这说明在骨骼肌静力性负荷所致损伤过程中肌细胞内ATP的含量没有降低,并未出现合成原料不足以及合成障碍而导致ATP含量降低的现象。

糖原或葡萄糖在缺氧条件下通过糖酵解生成乳酸,骨骼肌是乳酸生成的主要场所。大量乳酸解离后将使肌细胞内 H+的浓度显著升高。目前普遍认为肌细胞内 H+浓度升高是导致肌肉疲劳和损伤的一个重要因素。Murry等[14]认为乳酸、H+等酸性物质积聚可引起肌细胞超微结构的损伤。Armstrong[15]认为运动性肌肉损伤与肌肉收缩导致的局部 PH值下降所产生的负面效应有关。

本研究表明,在骨骼肌静力性负荷所致损伤过程中,骨骼肌细胞胞浆内乳酸及血乳酸含量的变化均表现为施加负荷 3天时即产生明显变化,且 2-4周时较3天 -1周时更为明显。这说明,大鼠在进行静力性运动的过程中,由于肌内压持续较高,局部血管受压,造成肌肉血供和代谢产物排出障碍,进而导致骨骼肌缺血、缺氧,骨骼肌的能量代谢方式以无氧糖酵解供能为主,乳酸生成增加。值得注意的是,胞浆内乳酸及血乳酸的变化与骨骼肌微观结构损伤的发生和变化趋势一致,由此提示骨骼肌细胞内乳酸等代谢产物堆积产生的毒副作用与骨骼肌静力性损伤密切相关。

4 结论

(1)骨骼肌细胞能源物质耗竭、能量供应不足以及糖类氧化不足所引起的三羧酸循环中介物缺乏并非导致骨骼肌静力性损伤的直接原因。

(2)骨骼肌细胞内乳酸等代谢产物堆积产生的毒副作用可能是引起骨骼肌静力性损伤的重要因素。

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Changes of EnergyM etabolism in the SkeletalM uscle of Rats in Injury Induced by the Dynam ic Load

Chen Xiao-guang,L iu Yue
(School of Physical Education,He’nan Nor malUniversity,Xinxiang 453007)

The animalmodel of injury induced by the dynamic load of skeletalmuscle is used to observe changesof muscle glycogen,ATP activity of muscle mitochondria,cytoplasmic and lactic acid of serum of injury to discuss the relation between change of energy metabolism of skeletal muscle cell and injury induced by dynamic load of skeletal muscle.Results show that TAC resulting from energy material depletion,unbalanced energy supply and carbohydrate oxidative insufficiency is not the direct cause of injury of dynamic load and the important factor accounting for injury of dynamic load is likely to be the side-effect produced bymetabolite accumulated through lactic acid ofmuscle cell.

muscle cell,injury of dynamic load,energymetabolis m

G804.2

A

1001—9154(2010)09—0065—04

book=65,ebook=82

G804.2

A

1001—9154(2010)09—0065—04

河南省教育厅自然科学基金项目 (2008B890008)、河南师范大学青年科学基金项目 (2008qk26)

陈晓光 (1975-),男,甘肃天水人,硕士,讲师。研究方向:运动人体科学。

2010—07—22