用rpsL基因突变实验评价丙烯酰胺致突变性的方法初探

刘清岱, 王志伟, 安红杰, 张治洲

(天津科技大学食品科学与生物技术学院,天津 300457)

用rpsL基因突变实验评价丙烯酰胺致突变性的方法初探

刘清岱, 王志伟, 安红杰, 张治洲

(天津科技大学食品科学与生物技术学院,天津 300457)

采用rpsL基因突变实验对丙烯酰胺的致突变性进行了初步研究。实验设0.05、0.10、0. 25、0.50、1.00 mg/mL 5个丙烯酰胺的剂量组和阴性、阳性对照组。结果发现,丙烯酰胺剂量组的突变频率与阴性对照组相比均有显著差异,并且有剂量效应关系,表明丙烯酰胺可诱发rpsL位点的突变。由于rpsL突变实验自发突变背景水平低、灵敏度高,因此rpsL突变实验有望成为食品和医药领域中致癌物快速检测的有效工具。

rpsL基因突变;丙烯酰胺;致突变性

丙烯酰胺(acrylamide)作为工业加工合成聚丙烯酰胺的主要材料,广泛应用于人类生产、生活和科研等领域。大量研究表明,丙烯酰胺不仅具有较强的神经毒性,而且也具有一定的致突变作用[1]。国际癌症研究机构对其致癌性进行了评价,将丙烯酰胺列为二类致癌物[2]。近年来,瑞典和德国学者发现某些富含淀粉的食品在经过高温加工处理后可检测出丙烯酰胺,使得食品中丙烯酰胺的污染问题引起了国际社会和各国政府的高度关注[3-4]。然而,目前很少有文章从分子生物学角度对丙烯酰胺的致突变原理进行研究,因此有必要利用基因突变实验研究丙烯酰胺的致突变性。

作者以质粒pMOL21的rpsL基因作为选择标记进行致突变性的检测。由rpsL基因编码的核糖体蛋白S12可以与链霉素(Sm,streptomycin)形成复合物,并增强链霉素与细菌16S rRNA结合的能力,从而阻止了转录的起始,这就是链霉素药理作用的基础。若rpsL基因发生突变,将破坏16S rRNA与链霉素的相互作用,而导致细胞对链霉素产生耐药性[5]。作者采用的宿主菌MF101的rpsL基因是突变的,具有链霉素抗性;而质粒pMOL21包含氨苄青霉素抗性和正确的rpsL基因序列。当pMOL21转化入宿主细胞后,只有质粒的rpsL基因被诱发突变才会导致宿主细胞具备链霉素抗性(链霉素抗性为隐性的遗传表型),从而达到正向筛选突变rpsL基因的目的[6]。本研究的实验方法是一种灵敏度高且简便易行的体外短期致突变实验方法,为检测食品加工过程中产生的潜在致癌物提供了一种快速有效的分析方法。

1 材料与方法

1.1 细胞株和质粒DNA

大肠杆菌MF101:具有链霉素抗性,可进行rpsL突变型质粒的筛选;质粒pMOL21(4.1 kb),包含氨苄青霉素抗性和rpsL基因序列。菌株和质粒均由日本奈良科技大学Hisaji Maki教授赠予。

1.2 主要试剂

氨苄青霉素(Ap,ampicillin),链霉素(Sm, streptomycin),丙烯酰胺(acrylamide),溴化乙锭(EB)等:均购自上海生工生物工程技术公司。

1.3 感受态细胞的制备与转化

采用CaCl2法制备感受态细胞[7],将质粒pMOL21转化至大肠杆菌MF101,涂布在含氨苄青霉素(50μg/mL)的LB琼脂平板上筛选转化菌。

1.4 细菌的培养和丙烯酰胺质量浓度的确定

将带有质粒pMOL21的大肠杆菌MF101培养至对数生长期(OD600为0.6左右),以1∶100的比例稀释至含有丙烯酰胺的LB液体培养基中,37℃振荡培养,并且以600 nm处的光吸收值测定大肠杆菌的生长曲线。

丙烯酰胺设0.05、0.10、0.25、0.50、1.00 mg/mL共5个剂量组;以溴化乙锭(EB)作阳性对照,终质量浓度为0.1 mg/mL;以无菌的去离子水作为阴性对照。各组均培养10 h后用于rpsL突变频率的测定。

1.5 rpsL基因突变频率的测定

将细菌培养液涂布于含氨苄青霉素的平板(50 μg/mL)上来确定转化细胞的总数;涂板于含氨苄青霉素和链霉素(50μg/mL)平板上以确定rpsL基因突变的总数。突变率是突变菌数(含Ap和Sm平板的菌数)/总菌数(含Ap平板的菌数)。每组至少3次重复,总菌落数不低于106个,用SAS 8.0进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 丙烯酰胺对大肠杆菌生长的影响

研究了不同浓度的丙烯酰胺对大肠杆菌MF101/pMOL21生长在不同时间的影响,所得结果见图1。从图1可看出,对照组的大肠杆菌细胞振荡培养达到稳定期的时间约为7 h。随着丙烯酰胺剂量的增加,达到稳定期的时间有所延长,当丙烯酰胺质量浓度达到1 mg/mL时,大肠杆菌细胞振荡培养达到稳定期滞后到10 h左右。细胞对数生长期的延长,表明了一定质量浓度的丙烯酰胺抑制了大肠杆菌细胞的生长,对于大肠杆菌具有明显的细胞毒性。

图1 丙烯酰胺对大肠杆菌MF101/pMOL21生长的影响Fig.1 Effects of acrylamid onE.coliMF101/pMOL21 growth

2.2 丙烯酰胺诱发的rpsL位点的突变频率(Mutation Frequency,MF)

研究了不同质量浓度的丙烯酰胺对大肠杆菌MF101/pMOL21的rpsL位点的诱导突变频率,所得结果见表1。在以水作为阴性对照测定的rpsL基因的自发突变率为1.85×10-6,这与日本奈良科技大学Hisaji Maki报道基本是一致的[8]。作者选择分子生物学实验室常见的诱变剂EB作为阳性对照,在较低质量浓度下(0.01 mg/mL)即显示出强的致突变性,阳性对照组突变频率是阴性对照的6倍以上。

表1 丙烯酰胺诱发的rpsL基因突变频率Tab.1 TherpsLgene mutation frequencies induced by acrylamide

从表1中可以看出,不同质量浓度的丙烯酰胺下的突变频率具有一定的剂量反应关系。为此,作者将这些数据进行了回归分析,所得结果见图2。

图2 rpsL基因突变频率与丙烯酰胺浓度的关系示意图Fig.2 Effects of acrylamide on therpsLgene mutation frequencies

从图2可以看出,丙烯酰胺的不同剂量组与对照组相比均有显著性差异,并且有剂量反应关系。各质量浓度的丙烯酰胺与对照组相比均有显著性差异(p<0.05),该检验线性显著(R2=0.945,F= 87.26)。

3 结 语

本研究中阳性对照组rpsL基因的突变频率是阴性对照的6倍以上,根据rpsL基因突变实验成立的条件判断,实验结果是可靠的。随着丙烯酰胺作用剂量的增加,rpsL位点的突变频率显著增加,并且有剂量效应关系,表明丙烯酰胺可以诱发rpsL位点的突变。值得关注的是,质量浓度为0.05 mg/ mL的丙烯酰胺组和对照相比也呈现了显著的差异,说明了该系统具有高度的灵敏性。

目前rpsL基因正向选择系统主要应用于DNA聚合酶扩增产物突变率的检测[9]。国内有关利用rpsL基因进行细菌耐药性的研究进行得很多,但是还没有利用该系统定量测定化合物的致突变性。常用的致突变性评测系统主要采用哺乳类细胞正向突变实验,即HPRT基因突变试验和TK基因突变实验[10-11]。但是这些实验均需要复杂的哺乳细胞培养条件,且实验过程大多在10 d以上。采用rpsL系统进行检测,整个分析过程可以在24 h内实现。同时rpsL分析背景较低,如TK基因的自发突变率为10-5[11],而rpsL的自发突变率低至10-6,远低于同类正向筛选体系。此外,采用rpsL正向选择系统进行丙烯酰胺导致的突变性的评价不需要复杂的实验条件,节省人力物力。因此rpsL基因突变实验有望成为食品和医药领域中致癌物快速检测的有效工具。

[1]袁媛,胡小松.丙烯酰胺毒性的研究进展[J].食品工业科技,2005,26(4):187-189. YUAN Yuan,HU Xiao-song.Recent research on toxicity of acrylamide[J].Science and Technology of Food Industry, 2005,26(4):187-189.(in Chinese)

[2]Tareke E,Rydberg P,Karlsson P,et al.Analysis of acrylamide,a carcinogen formed in heated food stuffs[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2002,50:4998-5006.

[3]Konings E J M,Baars A J,Klaveren J D,et al.Acrylamide exposure from foods of the Dutch population and an assess-ment of the consequent risks[J].Food and Chemical Toxicology,2003,41:1569-1579.

[4]刘稷燕,江桂斌.食品中的丙烯酰胺及其形成机制[J].化学进展,2004,16(6):1000-1007.

LIU Ji-yan,J IANG Gui-bin.Acrylamide in foodstuffs and its formation mechanism[J].Progress in Chemistry,2004,16 (6):1000-1007.(in Chinese)

[5]黄海南,韩金祥,王进鸿,等.链霉素耐药结核分支杆菌rpsL基因分析[J].遗传学报,2003,30(4):376-381.

HUANG Hai-nan,HAN Jin-xiang,WANGJin-hong,et al.rpsLgene analysis associated with streptomycin resistance inMycobacterium tuberculosis[J].Acta G enetica Sinica,2003,30(4):376-381.(in Chinese)

[6]杨文娟,沈涔超,张治洲.检测纳米材料毒性的若干实验方法[J].中国生物工程杂志,2009,29(2):119-124.

YANG Wen-juan,SHEN Cen-chao,ZHANG Zhi-zhou.Several approaches for toxicity assessment of nanomaterials[J]. China Biotechnology,2009,29(2):119-124.(in Chinese)

[7]张岚岚,徐春燕,徐昌杰.大肠杆菌感受态细胞转化能力的影响因素[J].细胞生物学杂志,2004,26:429-432.

ZHANGLan-lan,XU Chun-yan,XU Chang-Jie.Factors affecting transformation ability of competentEscherichia colicells[J].Chinese Journal of Cell Biology,2004,26:429-432.(in Chinese)

[8]Yoshiyama K,Higuchi K,Matsumara H,et al.Directionality of DNA replication fork movement strongly affects the generation of spontaneous mutations inEscherichia coli[J].Journal of Molecular Biology,2001,307:1195-1206.

[9]Lackovich J,Lee J,Chang P,et al.A measuring fidelity of platinum Pfx DNA polymerase[J].FOCUS,2001,23:6.

[10]张勇,张立实.两种人类淋巴母细胞TK、HPRT基因突变实验比较研究[J].癌变.畸变.突变,2007,19(1):36-39.

ZHANG Yong,ZHANGLi-shi.Comparisons of induced mutations at TK and HPRT loci using two human lymphoblastoid cell lines[J].Carcinogenesis Teratogenesis and Mutagenesis,2007,19(1):36-39.(in Chinese)

[11]郑卫平,吕敬章,孙秀发,等.用TK基因突变试验评价丙烯酰胺的致突变性[J].食品科学,2006,27(9):250-252.

ZHENG Wei-ping,LU Jing-zhang,SUN Xiu-fa,et al.Application of tk mutation assay for mutagenicity with acrylamide [J].Food Science,2006,27(9):250-252.(in Chinese)

(责任编辑:李春丽)

Application ofrpsLMutation Assay for Mutagenicity with Acrylamide

LIU Qing-dai, WANG Zhi-wei, AN Hong-jie, ZHANG Zhi-zhou
(College of Food Engineering and Biotechnology,Tianjin University of Science and Technology,Tianjin 300457, China)

In this study,rpsLmutation assay was use as model to determine the mutagenicity induced by acrylamide.E.coliMF101 carried with pMOL21 was treated with different concentrations of acrylamide(0.05,0.10,0.25,0.50,1.00 mg/mL,respectively).The results showed that with the increasing of the acrylamide concentration,rpsLmutation frequency significantly increases.Furthermore,a dosage-dependent relationship was detected.The results present here strong suggested that therpsLmutation assay may be as a potential tool for investigating food and drug safety.

rpsLmutation assay,acrylamide,mutagenicity

TS 201.6

:A

1673-1689(2010)02-0298-04

2009-07-08

国家自然科学基金项目(30800255);教育部新世纪优秀人才计划;天津科技大学人才引进基金项目(20060432,20060424)。

刘清岱(1975-),男,满族,河北保定人,讲师,理学博士,主要从事生物化学与分子生物学方面的研究。Email:lqd@tust.edu.cn。