沙棘多糖HRP Ia生物活性初探

田晓艳, 刘延吉, 祝怀宇, 朱显静

(1.辽宁石油化工大学环境与生物工程学院,辽宁抚顺 113001;2.沈阳农业大学生物科学技术学院,辽宁沈阳 110161)

沙棘多糖HRP Ia生物活性初探

田晓艳1, 刘延吉＊2, 祝怀宇2, 朱显静1

(1.辽宁石油化工大学环境与生物工程学院,辽宁抚顺 113001;2.沈阳农业大学生物科学技术学院,辽宁沈阳 110161)

研究了沙棘多糖(Hippophae rhamnoidesL.polysaccharide,HRP)保健功能及其抑菌作用。分别对HRP、HRP I、HRP Ia进行自由基·OH、O·-2、R·清除、抑菌效果及最小抑菌浓度的测定。HRP Ia对·OH、O·-2及R·清除率最高,清除·OH、O·-2及R·所需最大质量浓度分别为:1 000、400、80μg/mL;HRP Ia对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、腊状芽孢杆菌等菌种均有一定的抑制作用。

沙棘多糖;多糖;自由基;抑菌作用;生物活性

沙棘(Hippophae rhamnoidesL)为胡颓子科植物,是防风固沙的理想材料。沙棘果实中的活性成分已达到190多种,油中的活性成分有106种,其中脂溶性维生素有6种,脂肪酸22种,脂类42种,黄酮和酚类36种。沙棘黄酮具有抗心肌缺氧缺血、抗心率失常、提高耐缺氧能力、降血脂、清胆固醇、抑制血小板聚集、抗溃疡、抗肿瘤、抗炎、抗过敏、抗氧化、抗衰老、抗辐射、抗菌、抗病毒以及增强免疫力等功效。沙棘多糖(HRP)有较强的抗氧化作用,还对引起病毒性心肌炎的病毒具有明显的抑制作用。华东师大黄晓青等采用沙棘果榨汁提油后的果渣及籽渣提取的2种沙棘多糖为材料,通过研究沙棘多糖对小鼠实验性高脂血症的影响,观察其降血脂作用,证明沙棘多糖具有降低血清LDLC,降低肝脏TC和高脂饮食引起的血糖升高,降低SGOT活性,保持肝脏功能。目前对多糖生物学功效的研究愈来愈引起国内外药理学家、生物学家和化学家们的兴趣,它已成为当代生物学的热门领域[1-4]。作者对沙棘多糖进行体外清除自由基活性及其抑菌作用进行了研究。

1 材料与方法

1.1 材料

沙棘多糖:由沈阳农业大学生物科学技术学院实验室自行制备;细菌:大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、腊状芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌;真菌:番茄煤霉、棉花红腐、黑曲霉由沈阳农业大学生物科学技术学院微生物实验室提供。

1.2 方法

1.2.1 清除·OH的测定 参考Fenton反应体系,体系中加入水杨酸,则产生有色产物,并在波长510 nm处有强吸收;若反应体系加入具有清除· OH功能物质,则与水杨酸竞争·OH,使有色产物生成量减少[5]。清除率E(%)=[A0(对照)-A510 (样品)]/A0(对照)×100%。

1.2.2 清除O·-2的测定 邻苯三酚在碱性条件下能迅速自氧化,产生超氧阴离子自由基(Superoxidea nionf reer adical,SAFR),此SAFR继续加速其自氧化反应。若及时清除SAFR,就会抑制其自氧化反应速率,借此观察沙棘水溶性多糖对SAFR的影响[6]。

1)邻苯三酚自氧化产物吸收曲线的制备:对3 mmol/L邻苯三酚在p H 8.2,0.1 mol/L Tris-HCl缓冲液中的自氧化产物进行扫描(扫描范围280～600 nm),确定测试波长。取2.8 mL的Tris-HC1 (p H 8.2)缓冲液,2 mL蒸馏水,混匀后在25℃水浴中保温20 min,取出后立即加入在25℃预热过的3 mmol/L邻苯三酚0.2 mL,空白管为10 mmol/L HCl,迅速摇匀后倒入比色杯,325 nm下每隔30 s测定吸光度,计算线性范围内每分钟吸光度的增加ΔA0,即邻苯三酚的自氧化速率。自氧化速率为ΔA0/Δt=0.006/min。

2)沙棘多糖清除O·-2的测定:按上述方法操作,在加入邻苯三酚前,先加入一定体积的多糖溶液,蒸馏水减少相应体积。清除率E(%)=(ΔA0/ Δt-ΔA/Δt)/(ΔA0/Δt)×100%。ΔA0为邻苯三酚的自氧化反应速率,ΔA为加入多糖溶液后邻苯三酚的自氧化反应速率。

1.2.3 清除R·的测定 浓乙醇在碱性有氧环境、强紫外线下光解产生CH3CHOH2,CH3C作为自由基引发剂,直接作用于大豆植物油分中的多不饱和脂肪酸形成R,经共轭和氧化形成脂过氧自由基(ROO·),再分解为丙二醛(MDA),它可以与硫代巴比妥酸(TBA)发生反应,产生红色物质。产生的反应体系含乙醇体积分数95%、大豆油体积分数0.01%,0.1 mol/L FeSO4-EDTA,0.1 mol/L磷酸缓冲液(p H 8.0)及不同质量浓度的多糖,紫外光照射60 min。再加20%三氯醋酸1 mL,混匀,加0.67%TBA 1.5 mL,沸水浴10 min,532 nm测定吸光度,清除率(E%)=(A0-A样品)/A0× 100%[6]。

1.2.4 抑菌效果的测定 将沙棘粗多糖HRP及HRP Ia分别配制成质量浓度为200μg/mL的饱和多糖溶液备用。将已灭菌的滤纸片置于灭菌的沙棘多糖HRP及HRP Ia溶液中,浸泡30 min,无菌生理盐水作对照。制作菌平板,4次重复。同一培养皿中,生理盐水浸泡1片滤纸片作为对照,多糖液浸泡2～3片滤纸片。细菌培养24 h,观察其抑菌效果并测定抑菌圈的直径。真菌培养48 h,观察其抑菌效果并测定抑菌圈的直径。

1.2.5 最小抑菌浓度(MIC)的测定 将HRP及HRPⅠa配制成质量浓度为6.25～200μg/mL系列溶液。取不同质量浓度的多糖液各1.0 mL,再取各菌悬液0.2 mL,倒入60℃左右的固体培养基中充分混匀,冷却凝固后倒置恒温培养,2次重复,不长菌的最低质量浓度为最小抑制质量浓度。

2 结果与分析

2.1 沙棘多糖对·OH的清除

由图1可以看出,在200～1 000μg/mL的范围内,HRP、HRP I、HRP Ia对·OH清除率随多糖质量浓度增加而增大,且最大清除率为HRP Ia(71.1%)>HRP I(66.9%)>HRP(10.3%),推测HRP Ia是清除·OH的主要活性物质。

图1 沙棘多糖对·OH的清除Fig.1 Scavenging effect of HRP,HRP I,HRP Ia on ·OH

2.2 清除O·-2的测定

邻苯三酚的自氧化曲线见图2,线性关系为y=0.005 8x+0.34,所以取ΔA0/Δt=0.006/min。

图2 邻苯三酚自氧化曲线Fig.2 Self-oxidation of Pyrogallol

由图3可知,在80～400μg/mL的质量浓度范围之内,HRP、HRP I、HRP Ia对O·-2的清除率随多糖质量浓度增加而增大。但在400～480μg/mL区域内,HRP I、HRP Ia的清除率均有所下降,推测是由于多糖的质量浓度过高产生了助氧化作用,从而使清除率下降。最大清除率分别为HRP Ia (55%)>HRP I(51.2%)>HRP(33.3%),推断HRP Ia是清除O·-2的主要活性物质。

图3 沙棘多糖对O·-2的清除Fig.3 Scavenging effect of HRP,HRP I,HRP Ia on O·-2

2.3 沙棘多糖清除R·的测定

由图4可知,在80～480μg/mL的质量浓度范围内,HRP、HRP I、HRP Ia对R·的清除率随着多糖质量浓度的增加而减小。这可能是由于在自由基引发剂存在的条件下,多糖也可能自动氧化,产生新的有机自由基,高质量浓度多糖清除的自由基数目可能少于其自身产生自由基的数目;但低质量浓度的多糖溶液中,可能是减少了多糖分子与自由基引发剂的反应几率,从而表现出多糖的抗氧化作用。沙棘多糖对R·的清除率远小于对·OH、O·-2的清除作用,最大清除率分别为:HRP Ia (30.05%)>HRP I(25.38%)>HRP(2.14%),再次推断HRP Ia是清除R·的主要活性物质。

图4 沙棘多糖对R·清除Fig.4 Scavenging effect of HRP,HRP I,HRP Ia on R·

2.4 沙棘多糖抑菌作用

沙棘多糖的抑菌实验结果显示,沙棘多糖HRP Ia对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、腊状芽孢杆菌、番茄煤霉、棉花红腐等菌种均有一定的抑制作用。沙棘多糖HRP仅对于大肠杆菌、腊状芽孢杆菌有一定抑制作用,对于真菌无抑制作用。但沙棘多糖对苏云金芽孢杆菌、黑曲霉均无抑制作用,见表1,2。

表1 沙棘多糖对细菌的抑菌圈大小Tab.1 Size of antimicrobial circle of HRP and HRP Ia to bacterium单位:mm

表2 沙棘多糖对真菌的抑菌圈大小Tab.2 Size of antimicrobial circle of HRP and HRP Ia to fungus单位:mm

2.5 最小抑菌浓度(MIC)的测定

1)HRP最小抑菌浓度(MIC):MIC腊纸状芽胞杆菌为25μg/mL;MIC大肠杆菌为50μg/mL。

2)HRP Ia最小抑菌浓度(MIC):MIC大肠杆菌为25μg/mL;MIC腊纸状芽胞杆菌为12.5μg/ mL;MIC枯草杆菌为12.5μg/mL;MIC番茄煤霉为50μg/mL;MIC棉花红腐为200μg/mL。

3 讨 论

沙棘多糖HRP、HRP I和HRP Ia具有清除· OH、O·-2及R·的功能,并且清除率分别为HRP Ia>HRP I>HRP。因为HRP是粗多糖,进一步提取后得HRP I,再纯化得HRP Ia,前期提取实验各组分得率分别为:HRP 10.17%、HRP 18.95%、HRP Ia 3.2%;HRP的得率是HRP Ia得率的3.18倍[7],而HRP Ia清除自由基的能力是HRP的1.65～14.04倍。说明精多糖HRP Ia是主要活性物质,而粗多糖HRP及HRP I中其他杂质的活性低。精多糖HRP Ia主要由木糖、甘露糖、葡萄糖组成,这些单糖都含有还原性半缩醛基,这可能与多糖的抗氧化活性有关。沙棘多糖HRP Ia的抑菌效果再一次证明了HRP Ia是沙棘多糖中主要活性物质。

1)沙棘多糖具有清除·OH、O·-2及R·的功能,并且清除率HRP Ia>HRP I>HRP。HRP Ia清除·OH、O·-2及R·所需最大质量浓度分别为:1 000、400、80μg/mL。

2)沙棘多糖HRP Ia对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、腊状芽孢杆菌、番茄煤霉、棉花红腐等菌种均有一定的抑制作用;沙棘多糖HRP仅对于大肠杆菌、腊状芽孢杆菌有一定抑制作用,对于真菌无抑制作用。HRP最小抑菌浓度(MIC):腊状芽胞杆菌25μg/mL;大肠杆菌50μg/mL。HRP Ia最小抑菌浓度(MIC):大肠杆菌25μg/mL;腊状芽胞杆菌12.5μg/mL;枯草杆菌12.5μg/mL;番茄煤霉50μg/ mL;棉花红腐200μg/mL。

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(责任编辑:李春丽)

Determination of Polysaccharide HRP Ia Biological Activity from Hippophae rhamnoidesL.

TIAN Xiao-yan1, LIU Yan-ji＊2, ZHU Huai-yu2, ZHU Xian-jing1
(1.Environmental Technology and Biotechnology College,Liaoning University of Petroleum&Chemical Technology,Fushun 113001,China;2.Biotechnology College,Shenyang Agriculture University,Shenyang 110161,China)

This manuscript was to study the health function and bacteriostasis ofHRP fromHippophae rhamnoidesL.Through determining the scavenging capacity of·OH,O·-2,R, and bacteriostasis and minimal inhibitory concentration by HRP,HRP I and HRP Ia,it has been found proven that HRP Ia exhibit highest scavenging capacity on on·OH,O·-2and R·,The maximum concentration for cleaning these free radical is 1000,400,80μg/mL,respectively. Furthermore,HRP Ia can also inhibit the growth of E.coli,Bacillus subtilis,Bacillus cereus, and so on.

Hippophae rhamnoidesL,polysaccharide,free radical,bacteriostasis,biological activity

TS 241

:A

1673-1689(2010)02-0294-04

2009-05-25

国家863计划项目(2004AA247010)

田晓艳(1971-),女,辽宁沈阳人,农学硕士,讲师,主要从事食品生物技术方面的研究。Email:maggietian2002@163.com

＊通信作者:刘延吉(1959-),男,辽宁大连人,农学博士,副教授,主要从事食品生物技术方面的研究。Email: yanjiliu@yahoo.com.cn