清肺口服液对呼吸道合胞病毒感染人胚肺成纤维细胞PDGF－BB mRNA基因表达的影响＊

朱 越 袁 斌 于希忠 徐建亚 赵长江 吴琴琴

清肺口服液对呼吸道合胞病毒感染人胚肺成纤维细胞PDGF－BB mRNA基因表达的影响＊

朱 越1袁 斌2△于希忠3徐建亚1赵长江4吴琴琴1

目的观察清肺口服液含药血清对呼吸道合胞病毒(RSV)感染的人胚肺成纤维细胞(HELF)血小板衍生生长因子－BB(PDGF－BB)基因表达的影响。方法RSV攻击体外培养的HELF细胞后，以清肺口服液含药血清、利巴韦林含药血清及空白血清干预，采用实时荧光定量PCR法(RealTime－PCR)测定各组人胚肺成纤维细胞PDGF－BB mRNA表达变化。结果病毒对照组较正常细胞组PDGF－BB上升3倍，清肺口服液含药血清可显著降低PDGF－BB至RSV感染细胞的1/5。利巴韦林含药血清和空白血清作用相似，对PDGF－BB表达有一定的影响。结论RSV感染可使HELF细胞PDGF－BB mRNA表达水平显著升高;清肺口服液可调节PDGF－BB等细胞因子的mRNA表达，缓减RSV感染后细胞的异常变化，这可能是其抗病毒作用机制之一。

清肺口服液 呼吸道合胞病毒 血小板衍生生长因子－BB实时荧光定量PCR

1南京中医药大学(南京210029)

2南京中医药大学附属医院(南京210029)

3南京师范大学(南京210097)

4江苏省江阴市人民医院(江阴214400)

＊江苏省自然科学基金项目(No.BK2005219);江苏省六大人才高峰项目(No.2008022D)

△通讯作者

我们的前期临床研究显示，清肺口服液对小儿呼吸道合孢病毒(RSV)肺炎(尤其是痰热闭肺证)具有较好的临床疗效，且安全性良好[1];相应体外实验表明，感染RSV后的血小板衍生生长因子－BB(PDGF－BB)水平升高，而清肺口服液对其具有一定的调节作用。为进一步了解PDGF－BB在病毒性肺炎发病中的作用，阐明清肺口服液对病毒性肺炎的疗效机制，我们采用实时荧光定量PCR法 (RealTime－PCR)，从基因水平观察了各组RSV感染后人胚肺成纤维细胞PDGF－BB mRNA表达的变化。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 (1)动物:大耳白兔9只，雌雄各半，体质量2.5～3kg，由南京中医药大学实验动物中心提供。(2)细胞:人胚肺成纤维细胞HELF、人喉癌表皮细胞Hep－2，由凯基生物科技发展有限公司提供。本实验采用第5～30代细胞。(3)病毒:呼吸道合胞病毒A亚型Long株，由广州博特生物工程有限责任公司提供，在Hep－2上增殖活化。(4)药品:清肺口服液(含麻黄、葶苈子、虎杖等，南京中医药大学附属医院制剂室负责制剂和质量控制，每毫升含生药1mg)，利巴韦林颗粒(四川百利药业有限责任公司生产)。(5)试剂:DMEM培养基(GIBICO，美国)，新生牛血清 (四季青公司，杭州)，胰蛋白酶 (GIBICO，美国)，Trizol试剂(Invitrogen，美国)，M－MLV反转录酶(PROMEGA公司，美国)，SYRB Green I(STRATAGENE，美国)，人 PDGF－BB、β－actin上下游引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。(6)主要仪器设备:MCO－20AIC二氧化碳培养箱、超净工作台、MDF－382超低温冰箱(SANYO，日本)，IX50型倒置显微镜(Olympus，日本)，5417 型低温高速离心机(EPPENDORF，德国)，Biophometer生物分光光度计 (EPPENDORF，德国)，Mx3000P荧光定量PCR 仪(Stratagene，美国)。

1.2 方法 (1)含药血清及空白血清的制备:将动物随机分为3组。A组灌服清肺口服液，给药剂量48g/(kg·d)，分两次给予(相当于临床等效剂量的4倍)，B组灌服利巴韦林溶液，剂量31mg/(kg·d)。C组给等体积生理盐水，连续给药3d;末次给药前12h禁食不禁水。末次给药1h后，颈动脉分离取血，血液静置30min后，离心取血清，56℃水浴30min灭活，在超净工作台上过滤除菌，分装于1.5mL EP管，－70℃冰箱保存备用。(2)人喉癌上皮细胞(Hep－2)的培养:人喉癌上皮细胞置于37℃、5%CO2孵箱中培养。培养液可选用DMEM加10%新生牛血清，生长状态良好的细胞每2～3天可传代，0.25%胰酶消化，常温下约需2min，以镜下观察细胞回缩变圆时停止消化，每次分3～4瓶。(3)病毒的扩增:待Hep－2在25mL培养瓶中长至60% ～70%满后，倒去液体，加入适量(300～500μL)病毒液，37℃、5%CO2培养箱中吸附1.5h后，补充维持液(DMEM培养液含2%新生牛血清)3mL。逐日观察细胞病变(CPE，典型病变为融合的大泡)，病变达75%以上时收集病毒液，2000r/min离心8min，分装，－70℃保存备用。(4)含药血清和含利巴韦林血清对细胞最大无毒浓度测定:1×105/mL浓度的HELF细胞悬液加入96孔细胞板，每孔0.1mL，培养24h;以DMEM单培稀释清肺口服液含药血清、利巴韦林含药血清及空白血清，依次设50%、40%、30%、20%、10%4个浓度;将长成单层细胞的细胞板弃去培养液，分别加入各浓度的含药血清及空白血清 ，每孔0.1mL，并设正常细胞对照组;置37℃、5%CO2培养箱中培养，每日观察细胞病变，连续观察5d。细胞无病变的最低稀释度为最大无毒浓度进行以下实验。(5)呼吸道合胞病毒组织培养半数感染量(50percent Tissue Culture Infective Dose)TCID50的测定:以1×105/mL浓度的Hep－2细胞接种96孔细胞板，每孔0.1 mL。病毒悬液用DMEM单培10倍梯度稀释8个浓度(10－1)。在接种细胞后18～36h内，细胞长成单层时吸弃培养液，PBS液洗细胞面，接种各稀释度的病毒液，每个稀释度接种5孔，每孔50uL，并设正常细胞对照组。置37℃、5%CO2培养箱中吸附1.5h。吸弃病毒液，每孔加入2%维持液100μL，置37℃、5%CO2培养箱中培养，逐日观察病变。以最高稀释度不再出现新病变时为终点，细胞病变程度用(－)～(++++)表示:无细胞病变时为(－)，≤25%细胞出现病变为 (+)，25% ～50%为 (++)，50% ～75%为(+++)，＞75%为(++++)。根据公式计算TCID50:距离比率=(＞50%的百分数－50%)/(＞50%的百分数 － ＜50%的百分数)TCID50=大于50%的阳性百分率稀释度的对数+距离比率。(6)HELF细胞培养与分组:将复苏后的HELF细胞以1×106/瓶接种于25mL培养瓶中，加入DMEM全培 (含10%新生牛血清)，置37℃、5%CO2饱和湿度条件下培养。待细胞基本长满瓶壁后，用0.25%胰蛋白酶消化，进行传代培养。随着细胞数量的增多，分5组:含药血清组、空白血清组、利巴韦林血清组、病毒对照组、正常细胞组，每组2瓶细胞。(7)病毒攻击及细胞收获:培养24h，细胞长成单层(密度约90%以上)时，除正常细胞组外，各组细胞均弃上清液，用DMEM单培漂洗1遍后，加入100μL 100TCID50病毒液与100μL单培，置CO2培养箱吸附1.5h后弃去病毒液，DMEM单培漂洗2次，分别加入20%清肺口服液含药血清、20%空白血清、20%利巴韦林血清血清;正常细胞组和病毒对照组只加维持液，置细胞培养箱中培养24h。弃去各组上清液，PBS漂洗1遍，加入1mL单培，以细胞刮刀轻刮细胞至培养液中，2000r/min离心10min，收集细胞沉淀于1.5mL dorf管中。(8)细胞总RNA的提取:每组细胞沉淀中加入1mL Tizol，轻轻吹打，裂解细胞。4℃下12000r/min离心10min，离心，收集上清，转移到新的无RNA酶的1.5mL dorf管中。常温放置5min后，每1mL Trizol加氯仿200μL，剧烈震荡至呈粉红色。常温放置2～3min后，4℃下12000r/min离心10min，去上清，每1mL Trizol加500μL异丙醇，轻摇晃均匀。常温放置10min后，4℃下15000r/min离心16min，弃上清，加入75%乙醇(Rnase－free水配制)，12000转，4℃下15000r/min离心10min，洗沉淀，控干乙醇，RNA沉淀干燥5－10min后加Rnase－free水溶解，于Biophometer生物分光光度计上测定各组 RNA纯度及浓度，其中 A260/A280＞1.7，－80℃保存备用。(9反转录:5μL Rnase－free水，加1μL随机引物，加2μg RNA，70℃，5min混合，再置冰上速冻5min。然后依次加入5μL Buffer、0.625μL RNase抑制剂、1.25μL dNTP，加入补齐反应体系(25μL)所需相应量水，最后加1μL逆转录酶M－MLV。42℃逆转录1h，冰浴5min，合成cDNA第1链，－80℃保存备用。(10)9 Real Time PCR扩增β－actin、TGF－β1与PDGF－BB基因片断:在GenBank中进行搜索，获得所需序列，根据序列的5，末端与3，末端设计引物。各对引物序列如下。 PDGF－F:5'－CTG CTC ATC ATA TTC CAA CCC －3'。PDGF－R:5'－ CCT ACC ACA gTC TCC CTC CT －3'。退火温度:52℃。β －actin－F:5'－ GTG CGG AAg CCA ATC －3'。 β －actin－R:5'－ ACG GAC GAG GGA AAC AAT －3'。各取上述cDNA产物1μL做模板，利用SYBR Green I染料实时定量PCR检测药物处理后RSV感染的HELF细胞PDGF－BB的mRNA表达变化，以β－actin作为内对照。实时荧光定量PCR反应体系:7.5μL 2×Mix(含荧光染料 SYRB，dNTP 等)、上下游引物各 3μL、cDNA 1μL。扩增条件为:95℃预变性10min，95℃ 30s，52℃退火60s，72℃延伸30s，于Mx3000P荧光定量PCR仪内扩增40个循环。每份标本设2个复孔检测，取其循环阈值均值(Ct值，即PCR反应过程中出现荧光信号的初始循环数)。

采用比较2－△△Ct法分析各基因在细胞中的相对含量，按文献 [2]方法进行。即以管家基因β－actin作为内参基因相对定量，以各基因在RSV感染的HELF细胞中的表达结果作为对照组，计算各组细胞中相应基因的△△Ct值。△△Ct=(Ct目的基因 －Ct管家基因)实验组－ (Ct目的基因 －Ct管家基因)对照组，以△△Ct值为定量结果进行统计分析，则目的基因的量=2－△△Ct。

2 结果

2.1 含药血清和含利巴韦林血清对细胞最大无毒浓度测定与正常细胞组相比，浓度为50%、40%、30%的清肺口服液含药血清及利巴韦林含药血清组均见细胞内颗粒明显增多，有不同程度的细胞毒性。浓度为20%、10%的含药血清组细胞生长状态良好。故认为含药血清的最大无毒浓度为20%，并以此浓度进行以下相关实验。

2.2 RSV组织培养半数感染量 (TCID50) 呼吸道合胞病毒Long株 TCID50为 10－3.34/100μL。

2.3 细胞总RNA质量及纯度检验 每份样品的A260nm/A280nm吸光度比值均在1.8～2.0之间，说明所提RNA纯度较高。

2.4 药物处理后RSV感染的HELF细胞PDGF－BB的mRNA表达变化 结果显示，与正常细胞比较，病毒感染24h后，HELF细胞中PDGF－BB的表达量上升为3倍;而感染病毒后马上用空白血清或含利巴韦林的血清干预，HELF细胞中PDGF－BB的表达量回落为病毒对照组的1/2，但任然比正常细胞组稍高;与空白血清组或含利巴韦林组不同，感染病毒后马上用含清肺口服液的血清干预，HELF细胞中PDGF－BB的表达量回落为病毒对照组的近1/5，甚至比正常细胞组稍低(见表1，图1，图2)。

表1 各组细胞荧光定量Ct值及2－△△Ct值

图1 SYBR GreenI荧光定量PCR方法

图2 PDGF－BB、β－actin扩增曲线

3 讨论

在RSV肺炎病程中，RSV感染的致病作用不仅缘于对机体的直接损伤，尚可通过激活机体的免疫系统，产生多种细胞因子。这些细胞因子可以起到抗感染抗病毒作用，也可以成为致病因子参与炎症反应，进而导致肺纤维化、细胞凋亡，继发的毛细支气管炎和间质性肺炎等病理变化在疾病进展中起到重要作用。近年来人们对PDGF研究相对较多，目前已知PDGF是刺激细胞生长的主要致分裂原，对多种炎症细胞及成纤维细胞有趋化作用，其对调控肺成纤维细胞分裂、增殖及胶原蛋白的合成与降解起十分重要的作用[3]，也是有关各种原因所致肺间质纤维化形成机制研究的重点[4]。既往体外实验提示PDGF是通过与受体特异性结合而诱导成纤维细胞的趋化、分裂[5]，而肺成纤维细胞及肺内其他多种细胞均可表达PDGF－R，因此PDGF参与肺纤维化形成的机制及其与其他呼吸系统炎症性疾病的关系与也受到越来越多人们的重视[6]。

我们的前期研究表明，体外培养的人胚肺成纤维细胞感染RSV后，经ELISA法检测其细胞上清液中PDGF－BB含量较正常组明显增高。此次实验，我们利用RealTime PCR方法简单、快速、灵敏的特性，成功地检测到了各组细胞mRNA的表达，研究结果证实RSV感染可使PDGF－BB mRNA表达增高，说明病毒感染不仅可在蛋白质水平，亦可从mRNA水平调节其表达。实验中我们发现，RSV感染后PDGF－BB水平显著升高，诱导趋化、分裂多种炎细胞及成纤维细胞，促进各种细胞因子和炎症介质的释放，进而促进肺泡炎及肺纤维化形成，而清肺口服液可以拮抗这种异常变化。在清肺口服液含药血清作用后，过度升高的PDGF－BB水平回落降低至接近正常细胞水平。清肺口服液可调节PDGF－BB等细胞因子的mRNA表达，缓减RSV感染后细胞的异常变化，这可能是其抗病毒作用的机制之一。空白血清作用后，PDGF－BB水平也稍许降低，但清肺口服液含药血清与之比较作用更明显，显示了药物作用。利巴韦林含药血清与空白血清的作用相似，没有显示利巴韦林的作用，进一步佐证了利巴韦林抗病毒作用靶点的不在PDGF－BB上。

综上所述，炎症细胞因子PDGF－BB可能参与了RSV肺炎的致病过程，但RSV肺炎发病机制较为复杂，发病过程中有多种细胞因子共同参与。而中医药治疗病毒性肺炎的优势不仅在于单纯拮抗病毒，调整人体的免疫状态和增强组织自身的稳定性及抗损伤的能力的作用亦较明显[7]。调节PDGF－BB mRNA的表达可能是清肺口服液治疗小儿呼吸道合胞病毒肺炎疗效机制之一，但PDGF－BB究竟通过何种途径起作用以及清肺口服液如何在转录水平上调节PDGF－BB的表达，尚需更多的实验来进一步研究。

[1]袁斌，任现志，孙轶秋，等.清肺口服液治疗小儿呼吸道合胞病毒肺炎166例多中心单盲对照临床观察 [J].中医杂志，2009，50(3):221－223.

[2]Livak K J，Schmittgen T D.Analysis of relative gene expression data using realtime quantitative PCR and the 2－Ct method[J].Methods，2001，25(4):402 － 408.

[3]Matsuse T.Growthfactor in the process of inflammation and fibrosis in the lung[J].Nihon Kokyuki Gakkai Zasshi，1998;36(4):413 － 20.

[4]Hoyle G W，Li J，Finkelstein J B，et al.Emphysematous lesions，inflammation，and fibrosis in the lungs of transgenetic mice overexpressing platelet－ derived growth factor[J].Am J Pathol，1999;154(12):1763.

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[7]余如瑾，唐光华.浅谈中医防治呼吸道病毒感染性疾病的辨治及研究思路[J].中国中医药信息杂志，2003，10(7):18－20.

Effect of Qingfei Oral Liquid on PDGF-BB mRNA Expression of Respiratory Syncytial Virus Infected Human Embryonic Lung Fibroblasts

ZHU Yue1，YUAN Bin2，YU Xi-zhong3， et al
1 Nanjing University of Chinese Medicine(Nanjing 210029)
2 Affiliated Hospital of Nanjing University of Chinese Medicine(Nanjing 210029)
3 Nanjing Normal University(Nanjing 210097)

Objective:To study the effect of Qingfei Oral Liquid medicated serum on expression of PDGF－BB gene expression in Respiratory Syncytial Virus(RSV)infected Human Embryonic Lung Fibroblasts(HELF).MethodsHELF cells in vitro cultured infected with RSV were intervened by the Qingfei Oral Liquid medicated serum，the ribavirin medicated serum and the blank serum.The expression variation of the PDGF－BB in the HELF was detected by the Real－time fluorescence quantitative PCR method.ResultsComparing with normal cell，PDGF－BB with virus infection was decreased to 1/3.The PDGF－BB in the Qingfei Oral Liquid medicated serum group was increased to 2 times of that in RSV infected cells.Ribavirin medicated serum group and blank serum group have similar effect.They have certain effect on expression of PDGF－BB.ConclusionThe expression level of PDGF－BB mRNA in HELF cells infection of RSV could be decrease significantly.Qingfei Oral Liquid can regulate mRNA expression of PDGF－BB and attenuate the abnormal changes of RSV infected cells.It may be one of the mechanisms of its antiviral effect.

Qingfei Oral Liquid;Respiratory Syncytial Virus;Platelet derived growth factor(PDGF－BB);Real－time fluorescence quantitative PCR method

R285.5

A

1004－745X(2010)10－1727－04

2010－04－12)