Sysmex XE-2100血液分析仪定量检测成人网织血小板的方法学评价及参考区间建立

任春云，金明超，包丹妮，郭希超

(浙江大学医学院附属第一医院检验科，浙江 杭州 310003)

网织血小板(reticulated platelet,RP)或未成熟血小板于1969年由Ingram和Coopersmith首次发现，其胞质中含有残留核糖核酸(RNA)成分，被认为是一种新生的血小板,能较敏感地反映巨核细胞的血小板生成能力[1]，与成熟血小板相比，具有平均体积大和质量重的特点，应用于血小板减少、血小板增多症的诊断和骨髓造血功能恢复的预测[2]。九十年代开始使用流式细胞仪检测网织血小板，但因其操作复杂，缺乏质控，重复性差，价格贵等原因未能广泛采用。目前Sysmex XE-2100血细胞分析仪通过软件升级即可检测网织血小板参数—未成熟血小板比率(IPF immature platelet fraction)，根据美国病理家协会(CAP)对实验室质量管理和认可的要求[3]，实验室必须对新检测系统进行方法学评价并按就诊人群建立各自的本实验室参考区间，因此我们对Sysmex XE-2100检测网织血小板参数IPF检测系统进行性能评价试验并建立了本实验室的参考区间。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 标本来源 选取患者IPF高、中、低值做相关性能评价，批间精密度采用同一批次质控；选取248例来自我院2009年11月～12月的健康体检者，排除其他内外科疾病，血液生化及影像资料无明显异常者，用于确定参考区间，其中男性122例，女性126例，年龄17～81岁，平均37岁。

1.1.2 标本采集 采用EDTA-K2抗凝管空腹采静脉血2ml，混匀后于2h内检测。

1.2 仪器和试剂

1.2.1 仪器及试剂 Sysmex XE-2100血细胞分析仪并且系统软件升级版，聚次甲基染料、氨丁三醇缓冲液、鞘液试剂、质控等,均为该公司原装配套试剂。

1.2.2 校准及质控 对Sysmex XE-2100血液分析仪用其配套校准品按校准程序校准，校准测定结果和靶值比较，根据需要对仪器参数进行修正，使结果和靶值偏差在可允许范围内，表明校准合格。仪器每日测试前均做本底检测和室内质控，检测指标在质控通过后进行。

1.3 检测方法

1.3.1 样本检测 采用CBC+RET通道自动计数,经稀释并染色后检测分析IPF。

1.3.2 精密度试验 选取IPF中值 (10.2±0.5×109/L)、低值(3.1±0.3×109/L)两种不同 IPF 水平的标本各10份,每份连续检测11次，去掉第一次结果，取后10次结果评价中、低组标本批内CV；取三种水平的质控，连续检测20天，评价批间CV。

1.3.3 携带污染率 取IPF绝对值高值 (21.2×109/L)标本、低值(4.0×109/L)标本各一份，连续检测 3次高值标本 (H1、H2、H3)，再连续检测3次低值标本(L1、L2、L3)，其携带污染率=(L1-L3)/(H3-L3)×100%。

1.3.4 稳定性试验 选取10名健康志愿者，同时采集2份标本，室温保存(22℃左右)，分别用于：①短期稳定性：在 0、1、2 、4、8和 12 h后上机检测。 ②长期稳定性：在 0、12、24、36h 后检测。

1.3.5 分析测量范围(AMR)评价 取IPF绝对值高值 (IPF%=14.0%、IPF#=50.4×109/L)和低值 (IPF%=7.1%、IPF#=0.4×109/L)，分别以 4:1、3:2、1:1、1:2、1:3、1:10比例混合，共8个水平标本，标本中IPF绝对值按照比例计算，每一水平检测2次，计算，以期望值和测定值作回归分析。

1.4 建立参考区间

1.4.1 取上述248例标本上述方法检测分析结果。

1.4.2 统计学处理 采用SPSS 13.0分析软件，两组间比较采用独立样本t检验，男女分组采用Z检验，正常参考区间采用95%可信区间表示，数据以x±s表示。

2 结果

2.1 精密度试验(见表1、表2)。

表1 批内精密度

表2 批间精密度

2.2 携带污染率 IPF绝对值为：0.98%；IPF%为：0.36%。

2.3 稳定性试验 标本在8h内检测较稳定(CV均<6%),超过12h稳定性的变异系数CV偏高，提示检测网织血小板应在8h内完成结果稳定 (：P[IPF%]=0.12，P[IPF#]=0.25)。 (见图 1、表 3)。

2.4 分析测量范围 利用SPSS相关和回归分析，其相关系数γ=0.9975(P<0.01)，回归方程y=0.9998x+1.3028(图 2)。 按 α=1.00±0.05，γ≥0.97 为标准，AMR评价符合要求，本检测系统IPF的AMR为：50.4～0.4×109/L。

图1 均值随时间变化图

表3 IPF的稳定性

图2 IPF AMR

2.5 参考区间建立 248例健康体检者的血液标本IPF数据呈偏态分布，采用第2.5～97.5百分位数作为参考区间。男女分组采用Z检验[4]，IPF%:Z=4.16>Z*=3.05；IPF 绝对值：Z=3.95>Z*=3.05 男女组间存在差异，参考区间需要男女分组(见表4)。

表4 IPF的参考区间

3 讨论

根据美国病理学家协会(CAP)对实验室质量的管理要求，对新检测系统必须验证其相关分析性能。本实验结果显示，IPF%批内CV分别为4.9%、6.2%，批间CV分别为3.3%、3.9%、3.6%，IPF绝对值批内CV分别为 5.3%、8.0%，批间 CV分别为 3.4%、4.3%、4.8%，携带污染率分别为0.36%、0.98%，稳定性试验中8h内变异系数CV分别为5.4%、5.6%，36h CV分别为16.2%、20.4%，表明检(下转第462页)Dsg3抗体在天疱疮患者和类天疱疮患者中的阳性率差异有统计学意义(P＜0.05)。

3 讨论

天疱疮是自身免疫性疾病，其病理基础是抗体沉积在表皮内棘层细胞间，从而引起棘层细胞松解，形成表皮内水疱，在临床表现上与类天疱疮不易区分。实验室诊断方法有组织病理、直接免疫荧光、间接免疫荧光检测自身抗体。在病损部位取活体组织用直接免疫荧光法检测抗体，能看见IgG和C3沉积在棘层细胞间，而类天疱疮病人抗体沉积在表皮基底膜处，可资鉴别，该法诊断清楚，结果可靠，且阳性率高[1]。天疱疮患者的血清中有抗表皮物质间的抗体，一般使用猴食道或包皮为底物，用间接免疫荧光法可以检出，但其阳性率在两种底物上会有所不同。现代分子学已知寻常型天疱疮(PV)和落叶型天疱疮(PF)的抗原为来自表皮的钙黏素超家族的糖蛋白，分别是桥粒芯糖蛋白3(Dsg3)、桥粒芯糖蛋白1(Dsg1)。我们用ELISA法检测抗Dsg1抗体和抗Dsg3抗体，结果显示，在天疱疮病人血清中有较高的阳性率，而在类天疱疮病人的血清中未发现阳性，两者差异有统计学意义。

本研究中抗桥粒芯蛋白抗体的总阳性率高于文献报道[2]，这可能与我们所选病人多数为活动期有关，因为据文献报道天疱疮患者病情与抗桥粒芯糖蛋白抗体水平有相关性[3]。综上所述，直接免疫荧光法是一种十分可靠的诊断方法，但该法操作较复杂，结果判断要求有一定的病理学基础，而且取材不便，对于患者会造成损伤。间接免疫荧光检测自身抗体受底物影响。ELISA法操作简便，重复性好，待检标本只需10μl血清，阳性率较高。因此，ELISA法检测抗Dsg1抗体和抗Dsg3抗体在天疱疮的诊断和病情监测中有重要价值。

致谢：南昌大学第二附属医院 王小中 博士 审阅。

[1]赵永铿,罗瑞固,林页新,等.天疱疮患者不同部位皮肤及不同稀释度荧光抗体直接免疫荧光检查的对照研究 [J].中华皮肤科杂志,1989,23(4):228-229.

[2]张蜀澜,佟大伟,李永哲,等.天疱疮相关自身抗体的检测及其临床意义[J].检验医学,2007,22(5):551-553.

[3]闫 言,王宝玺,渠 涛,等.天疱疮患者病情与抗桥粒芯糖蛋白抗体水平的相关性研究[J].临床皮肤科杂志,2003,32(9):512-514.