高效液相色谱法检测兔血浆中甲氧滴滴涕的浓度

周红宇，肖仲祥，张馨，王萍，胡国新

（温州医学院 药学院，浙江 温州 325035）

甲氧滴滴涕（methoxychlor，MXC），又称甲氧氯，化学名为1，1-三氯-2，2-双（4-甲氧基苯基）乙烷，属有机氯杀虫剂，因具有高效和低残留的特点而取代滴滴涕（DDT）广泛应用，在土壤、工业废水及城市污水中均有检出[1-2]。近年来的研究表明MXC能干扰生殖内分泌系统，降低生育能力，并且具有遗传毒性，是重要的农药类内环境干扰物[3-6]。MXC为脂溶性物质，在受污染的环境中的可通过胃肠道、皮肤及呼吸道进入机体，但其在体内的毒动学过程尚缺乏研究。本研究采用高效液相色谱（HPLC）法检测血浆样品中的MXC浓度，并研究其在兔体内的毒代动力学过程。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 仪器：高效液相色谱仪为美国Agilent1100系列，包括G1322A在线脱气机，G1311A四元泵，G1313A自动进样器，G1316A柱温箱，G1315B二极管阵列检测器，Agilent化学工作站（Rev A.08.03.[847]）。电子分析天平，涡旋混合器，恒温水浴箱，台式高速离心机等。

1.1.2 药品与试剂：MXC（批号357-25，纯度98%，北京明尼克分析仪器设备中心）；马拉硫磷（批号5041-2168，纯度99.2%，安捷伦科技有限公司）；乙腈（一级色谱纯，德国默克公司）；乙酸乙酯，正己烷（色谱纯，天津四友生物医学技术有限公司）；甲醇（一级色谱纯，天津四友精细化学品有限公司）；NaF（批号20051125，纯度98%，上海三爱试剂有限公司）。

1.1.3 实验动物：日本大耳兔5只，体重（3.0±0.22）kg，由温州医学院实验动物中心提供，动物合格证号：浙医动字第2203001号。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件：色谱柱为Eclipse XDB-C18（4.6×150 mm，5μm，Agilent，USA），流动相为乙腈-水（70:30，V/V）。流速：1.0 mL/min；柱温：30 ℃；检测波长：240 nm；参比波长：380 nm；检测灵敏度：0.05 mAU；内标：马拉硫磷。

1.2.2 血浆样品预处理：准确吸取血浆1.0 mL于10 mL具塞试管中，加入25 g·L-1NaF 100μL，静置10min加入0.3 g·L-1马拉硫磷内标液40μL，加乙酸乙酯-正己烷（4:1，V/V）萃取液2 mL，涡旋混匀后3000×g 离心10 min，取上层有机相1.8 mL于另一锥底试管中，37℃水浴条件下氮气流吹干。用200μL流动相复溶，20μL进样检测。

1.2.3 标准曲线的制备：取9只10 mL具塞试管，加入空白血浆1.0 mL，25 g·L-1NaF 100μL，静置10 min后，加入不同浓度的MXC标准液，配成浓度相当于0.05、0.1、0.25、0.5、1.0、2.5、5、10 μg·mL-1的血浆样品，按“1.2.2”项”方法处理后，测定MXC峰面积Ai和内标峰面积As，以Ai/As为纵坐标，以所对应各点浓度（C）为横坐标绘制标准曲线。

MXC的标准曲线回归方程为血浆标准曲线：C=1.1573Ai/As-0.0245 (r=0.99993)；最低检测限均为0.05 mg·L-1。

1.2.4 方法验证：配制浓度分别为0.1、1.0和5.0 mg·L-1的MXC血浆标准品溶液，每个浓度平行5管，按文献[7]考察本方法的回收率和精密度。

1.2.5 动物实验：日本大耳兔5只，MXC用玉米油溶解灌胃，剂量为200 mg·kg-1，分别于给药前和给药后 5、10、20 min，1、2、4、6、9、 12、18、24 h，取静脉血2 mL，注入肝素化的试管，3000×g离心10 min，取血浆，-40 ℃保存备测。

1.2.6 数据处理：实验结果采用中国药理学会数学药理专业委员会编写的DAS药代动力学计算程序进行数据处理，用房室模型计算MXC的毒动学参数。

2 结果

2.1 方法验证 图1为空白血浆、MXC纯标、MXC血标、及含MXC的血浆样品经HPLC分析测定得到的色谱图。由图可见在本实验条件下，MXC与内标马拉硫磷能完全分离，没有明显的内生杂质峰干扰。内标的保留时间为3.4 min，MXC的保留时间为7.1 min。本方法具有较高的专属性，回收率和精密度符合生物样品分析指导原则的要求[8]（见表1）。

表1 回收率和精密度

图1 MXC血浆色谱图

图2 MXC浓度时间曲线

2.2 MXC在兔体内的毒代动力学 200 mg·kg-1MXC一次性灌胃后， 兔血浆中MXC的浓度时间曲线见图2。结果表明，MXC在兔体内的动力学过程呈双峰现象。因目前DAS软件无法拟合双峰现象，将整个体内过程分为（0.083～4）h和（4～24）h两个时间段处理，均符合一级动力学二室模型。主要的动力学参数见表2。

3 讨论

MXC为重要的环境激素类农药，可通过多种机制而产生生殖毒性，涉及氧化应激反应，拟雌二醇作用，对生殖细胞及胚胎的毒性及干扰神经、免疫系统的功能等[6]，已成为目前研究的热点。因此有必要建立统一、合理、灵敏的检测方法并开展毒代动力学研究，以了解MXC在动物体内血浆浓度变化的规律及其与各系统毒性作用的关系。目前MXC的检测主要采用气相色谱法和气质联用法[1-2，9]，用于环境、农产品、及生物样品中微量农药残留的检测，鲜见毒动学研究的报道。气质联用和气相色谱检测法灵敏度高，峰型好，能同时分辨多种农药，但仪器和试剂的成本也高，样品的前期处理复杂，对实验条件要求的较高。因MXC的毒性较低，家兔急性经口半数致死量>2000 mg·kg-1[6]。可适当加大给药剂量而获得较高的血药浓度，本实验中给兔灌服200 mg·kg-1的MXC，除个别动物有轻微的中枢兴奋外无其他异常中毒反应。因此本研究尝试用HPLC法检测血浆样品中的MXC浓度，并进行整体动物的毒代动力学研究。

表2 MXC在家兔体内的药动学参数

本研究中流动相采用乙腈和水，比例为70:30。在此条件下MXC与内标马拉硫磷能完全分离，没有明显的内生杂质峰干扰。提高乙腈的比例可使MXC出峰时间提前，峰型也更好，但内标马拉硫磷的出峰时间也提前，与血浆杂峰重叠；降低乙腈的比例可使MXC的出峰时间推迟，如比例为65:35时，MXC的出峰时间在10min左右，此时峰形变宽且与其后的杂峰有部分重叠。选择内标时，考虑到MXC脂溶性的特点，尝试了多种中枢抑制药、有机氯及有机磷农药，以马拉硫磷的出峰时间及峰型最为理想，但马拉硫磷在血浆样品中易被胆碱酯酶水解，因此血浆需事先用NaF处理，抑制胆碱酯酶活性。在本色谱条件下，出峰时间适当，峰形干净利落无干扰，而且所要求的预处理方法简便快速，适合动物实验中大量样本的检测。

毒代动力学研究表明，MXC 200 mg·kg-1灌胃后兔血浆中浓度的变化符合一级动力学二室模型；在给药后18 min和6 h出现两次峰浓度，分别为3.66和3.59 mg·L-1，双峰间隔时间较长，提示可能存在肝肠循环；两个时间段消除相半衰期分别为15.12和11.01 h，说明MXC一次性染毒后可在体内持续较长时间；MXC的血浆浓度较低，参照表2中V1、AUC及T1/2等药动学参数分析，MXC吸收完全，表观分布容积V1偏大，半衰期较长，因此其浓度偏低的原因可能主要是在组织中有较多的蓄积。MXC为低毒类有机氯农药，对人畜毒性小、使用安全，临床未见有急性中毒的报道，但其毒动学特点表明MXC在体内蓄积所致的慢性毒性仍需重视。

[1] 余彬彬,秦榜辉,牟义军,等. 气相色谱-串联质谱多离子监测分析土壤中的有机氯农药残留[J].分析试验室,2008,27(增刊):191-195.

[2] 陈明,任仁,王子健,等. 北京工业废水和城市污水中有机氯农药残留分析[J].中国环境监测,2007,23(4):29-32.

[3] Murono EP, Derk RC, Akugl Y. In vivo exposure of young adult male rats to methoxychlor reduces serum testosterone levels and ex vivo Leydig cell testosterone formation and cholesterol side-chain cleavage activity[J]. Reprod Toxicol,2006,21(2):148-153.

[4] Amstislavsky SY, Amstislavskaya TG, Amstislavsky VS, et al.Reproductive abnormalities in adult male mice following preimplantation exposures to estradiol or pesticide methoxychlor[J]. Reprod Toxicol, 2006, 21(2):154-159.

[5] Amenti AE, Zama AM, Passantino L, et al. Developmental methoxychlor exposure affects multiple reproductive parameters and ovarian folliculogenesis and gene expression in adult rats[J]. Toxicol Appl Pharmacol,2008,233(2):286-296.

[6] 常飞,陈必良. 环境激素类农药甲氧滴滴涕生殖毒性研究进展[J].国外医学:卫生学分册,2007,34(2):70-74.

[7] 周红宇,陈醒言,黄成珂,等.冰片对卡马西平在小鼠体内分布的影响[J]. 温州医学院学报, 2008,38(4):300-305.

[8] U.S. Food and Drug Administration, Centre for Drug Evauation and Research(CDER). Guidance for industry,bioanalytical method validation[EB/OL]. 2001[2009-08-02]. http://www.fda.gov/downloads/Drugs/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Guidances/UCM070107.pdf.

[9] 夏俊鹏,吴飞,刘红亚. 工作场所空气中甲氧滴滴涕的气相色谱测定方法研究[J].中国卫生检验杂志,2007,17(4):588-600.