毛细管柱气相色谱法测定精制马拉硫磷溶液含量

田恺，张浩然，张亦菲，徐汀，华贤辉，商军

(上海市兽药饲料检测所，上海 201103)

精制马拉硫磷溶液属于有机磷杀虫药，主要以触杀、胃毒和熏蒸杀灭虫害，具有广谱、低毒、使用安全等特点，多用于牛羊皮毛去虱除虫，其作为兽用杀虫药剂，广泛应用于牛羊产地多的地区。目前国内外检测马拉硫磷的方法主要有电化学法[1-2]、酶联免疫法[3]、分光光谱法[4]、气相色谱法[5-10]、液相色谱法[11-13]、气质联用法[14]和液质联用法[15]等，其中气相色谱法是最通用的检测方法。精制马拉硫磷溶液作为兽用制剂收载于《兽药质量标准》(2017年版，化学药品卷)中[8]，其含量测定为填充柱气相色谱法，采用该法测定精制马拉硫磷溶液含量的稳定性和准确性均较差，给检验工作带来了诸多麻烦。为了更好地控制精制马拉硫磷溶液质量，本研究建立毛细管柱气相色谱法测定精制马拉硫磷溶液含量，为该制剂的质量控制提供了一种新方法。

1 材料与方法

1.1 材料 气相色谱仪(Agilent 6890N，火焰离子化检测器FID，美国 Agilent公司，配B04.01C 化学工作站)；电子天平(AB135-S，瑞士METTLER TOLEDO 公司，精度为0.01 mg)；马拉硫磷对照品(中国兽医药品监察所，批号H0671311，含量为99.0%)；邻苯二甲酸二丙酯内标物质(北京曼哈格生物科技有限公司，批号B0002771，含量为99.5%)；精制马拉硫磷溶液(来源：企业1，规格：70%，批号：2019042801、2019042802、2019042803；规格：45%，批号：2019042701、2019042702、2019042703；企业2，规格：20%，批号20171201、20171202、20171203)；精制马拉硫磷原料(企业1提供，含量为96.5%)；空白辅料(乳化剂0202-C，乳化剂DZ-0248，乳化剂150，企业1和企业2提供)；丙酮(色谱级，德国默克公司，批号1404012802)。

1.2 方法

1.2.1 气相色谱条件 色谱柱：Agilent HP-5毛细管柱(固定相：5%苯基-95%甲基聚硅氧烷，规格：30 m×0.320 mm×0.25 μm)；柱温：230 ℃；进样口温度：250 ℃；检测器温度(FID)：265 ℃；载气：氮气；流速：2 mL/min；进样体积：1 μL(分流比50 ∶1)。

1.2.2 溶液制备

1.2.2.1 内标溶液的制备 取邻苯二甲酸二丙酯适量，加丙酮溶解并稀释成每1 mL中含20 mg的溶液，摇匀，作为内标溶液。

1.2.2.2 对照品溶液的制备 取马拉硫磷对照品约0.22 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入1.2.2.1项的内标溶液5 mL，密塞，振摇使溶解，作为对照品溶液。

1.2.2.3 供试品溶液的制备 分别取规格为20%供试品约1.10 g，规格为45%供试品约0.49 g，规格为70%供试品约0.31 g(约相当于精制马拉硫磷0.22 g)，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入1.2.2.1项的内标溶液5 mL，密塞并振摇使溶解，分别作为规格为20%、45%和70%的供试品溶液。

1.2.2.4 线性溶液的制备 取马拉硫磷对照品适量，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入1.2.2.1项的内标溶液5 mL，分别配制浓度为35.2、39.6、44.0、48.4、52.8 mg/mL的标准线性系列溶液。

1.2.2.5 回收率供试品溶液的制备 取空白辅料乳化剂DZ-0248、乳化剂150和精制马拉硫磷原料，按处方比例分别制备成规格为20%和45%精制马拉硫磷溶液各6份；取空白辅料乳化剂0202-C和精制马拉硫磷原料制备成规格为70%精制马拉硫磷溶液6份；取上述制备的供试品适量，精密称定，分别置于具塞锥形瓶中，精密加入1.2.2.1项的内标溶液5 mL，密塞并振摇使溶解，分别作为回收率供试品溶液。

1.2.3 供试品测定 分别取对照品溶液和供试品溶液，按1.2.1项的色谱条件操作，分别注入气相色谱仪，得对照品和供试品溶液中马拉硫磷和邻苯二甲酸二丙酯的峰面积，按内标法计算供试品中马拉硫磷含量。

2 结果与分析

2.1 色谱系统适用性考察 分别取对照品溶液及20%、45%和70%的供试品溶液，按1.2.1项的气相色谱条件操作，分别对马拉硫磷主峰的保留时间、马拉硫磷主峰和邻苯二甲酸二丙酯主峰的分离度、马拉硫磷主峰的理论板数进行考察，结果见表1和图1。实验结果表明，对照品溶液和供试品溶液中马拉硫磷主峰保留时间约为4.5 min，相对标准偏差(RSD)在0.07%～0.18%之间；马拉硫磷主峰和邻苯二甲酸二丙酯主峰的分离度均大于10，RSD均在0.18%～0.27%之间；马拉硫磷主峰的理论板数均大于20000，RSD在0.30%～0.46%之间，具有较好的色谱系统适用性。

表1 气相色谱系统适用性试验考察结果(n=6)Tab 1 Results of the chromatographic system suitability(n=6)

图1 对照品溶液和供试品溶液气相色谱图Fig 1 The chromatogram of the standard solution and the sample solution

2.2 线性关系考察 分别取1.2.2.4项中标准线性系列溶液1 μL，注入气相色谱仪，按1.2.1项的气相色谱条件操作，计算马拉硫磷峰面积与邻苯二甲酸二丙酯(内标)峰面积的比值，以马拉硫磷浓度(x)为横坐标，马拉硫磷峰面积与内标物质峰面积比值(y)为纵坐标，绘制标准曲线，结果见表2。实验结果表明，在马拉硫磷浓度在35.2～52.8 mg/mL范围内，线性关系良好。

2.3 回收率试验 分别取1.2.2.5项中回收率供试品溶液，按1.2.3项进行测定，记录色谱图，按内标法计算测定结果，结果见表3。实验结果表明，制备的20%精制马拉硫磷溶液的平均回收率为99.5%，标准偏差(SD)为0.2%，RSD为0.2%；制备的45%精制马拉硫磷溶液的平均回收率为99.6%，标准偏差(SD)为0.3%，RSD为0.3%；制备的70%精制马拉硫磷溶液的平均回收率为98.6%，标准偏差(SD)为0.3%，RSD为0.3%，方法的准确度较好。

表2 马拉硫磷的线性关系Tab 2 Linear relationship of malathion

表3 回收率试验测定结果Tab 3 Method recovery test results

2.4 精密度试验

2.4.1 重复性实验 取马拉硫磷对照品溶液1份，重复进样6次，按内标法计算校正因子，检验系统测定的重复性；取供试品一批，分别制备成供试品溶液6份进行测定，计算马拉硫磷和邻苯二甲酸二丙酯峰面积比值，检验供试品测定的重复性，结果见表4。实验结果表明，校正因子的RSD为0.47%；6份供试品峰面积比值的RSD为1.07%，系统和供试品测定重复性均良好。

2.4.2 中间精密度实验 分别取规格为20%、45%和70%的供试品各一批，分别于不同日期和不同人员，对上述供试品的含量进行测定，结果见表5。实验结果表明，不同日期和不同人员对规格为20%马拉硫磷含量测定结果的RSD为0.20%、规格为45%的RSD为0.10%、规格为70%的RSD为0.10%，精密度均较好。

表4 方法的重复性试验结果Tab 4 Repeatability test results of the method

表5 方法的中间精密度试验结果Tab 5 Intermediate precision test results of the method

2.5 溶液稳定性试验 取规格为20%、45%和70%的供试品溶液各一批，室温放置，分别于0、2、4、6、8、10、16、24 h后采集色谱图，考察马拉硫磷和邻苯二甲酸二丙酯峰面积的变化情况，在0～10 h，规格为20%、45%和70%的供试品溶液测得马拉硫磷和邻苯二甲酸二丙酯峰面积的RSD均小于1.5%；在16 h后峰面积均存在一定程度的下降。实验结果表明，供试品溶液在10 h内稳定。

2.6 供试品含量测定 分别取企业1规格为45%和70%的供试品及企业2规格为20%的供试品各3批，进行含量测定。结果见表6。实验结果表明，3个规格9批次供试品含量的平均标示量的RSD均小于0.5%。

表6 供试品测定结果(n=3)Tab 6 Results of sample determination(n=3)

3 讨论与结论

3.1 方法的选择 目前，从精制马拉硫磷含量测定的文献报道来看，精制马拉硫磷原料可采用HPLC法测定[11-12]，结果相对可靠；精制马拉硫磷溶液含量测定有HPLC法[13]和GC法[5,7-8]，其中GC法含量测定均为填充柱气相色谱法，采用该法测定精制马拉硫磷溶液含量的稳定性和准确性均较差；本实验也参考了文献报道方法[11-13]对精制马拉硫磷溶液(规格20%、45%和70%)含量测定进行了优化研究，结果表明，对规格为20%和45%的精制马拉硫磷溶液，由于其辅料组成较规格为70%的要复杂，马拉硫磷主峰与杂质峰很难通过优化方法来进行分离，导致含量测定结果的不准确，故HPLC法不适用于规格为20%和45%精制马拉硫磷溶液含量的测定。采用建立的毛细管柱气相色谱法就较好的解决了上述难题，大大缩短了分析时间，且结果可靠、准确。

3.2 检测器的选择 目前气相色谱用于马拉硫磷含量测定的检测器主要有火焰离子化检测器(FID)[5,7-8]、火焰光度检测器(FPD)[9]、氮磷检测器(NPD)[10]，其中FPD和NPD适用于样品中痕量或微量马拉硫磷的测定，精制马拉硫磷溶液的含量测定为常量分析，FID作为高灵敏度通用性检测器，适用于常量马拉硫磷含量测定，响应快，峰形好，色谱系统适用性试验结果满意，故选择FID是适宜的。

3.3 内标物质的选择 在收载的标准中采用丙体六六六作为内标物质[8]，其不易获得，且其毒性较大，长时间使用会对检测人员及环境造成危害，在研究过程中选择了毒性相对较弱的邻苯二甲酸二丙酯作为内标物质，其色谱峰的位置与马拉硫磷主峰的位置相近，且与精制马拉硫磷溶液中各组分的色谱峰均能完全分离。

3.4 柱温的选择 色谱柱温在150～250 ℃范围内对样品进行试验，试验结果表明，柱温为230 ℃的恒温条件下，马拉硫磷主峰、内标物质峰、溶剂峰、杂质峰的分离效果均较好且保留时间的重复性也较好，缩短了分析时间。

采用毛细管柱气相色谱法测定精制马拉硫磷溶液含量，该方法操作简便易行，专属性强、准确性高、重复性好等特点，适用于精制马拉硫磷溶液含量测定的质量控制。