Apo CⅢ基因多态性在中国汉族健康人群中的分布特点及与不同种族人群的比较

俞 娟,褚少朋,杨曙梅,陈翠丽,景蓉蓉,王惠民*

(南通大学1.附属医院检验医学中心;2.公共卫生学院,江苏南通 226001)

Apo CⅢ基因多态性在中国汉族健康人群中的分布特点及与不同种族人群的比较

俞 娟1,2,褚少朋1,杨曙梅1,陈翠丽2,景蓉蓉1,王惠民1*

(南通大学1.附属医院检验医学中心;2.公共卫生学院,江苏南通 226001)

目的探讨中国南通地区汉族人群载脂蛋白CⅢ(Apo CⅢ)基因多态性在健康人群中的分布特点,并与不同种族进行比较研究。方法收集中国南通地区74名无血缘关系健康个体的静脉血提取DNA,应用聚合酶链反应限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)结合微流控电泳技术,分别分析Apo CⅢ基因T-455C和C-482T的多态性。结果中国汉族人群Apo CⅢ-455C等位基因频率明显低于印度和哥斯达黎加人群(P＜0.01),与高加索和法国人群相似;中国汉族人群Apo CⅢ-482T等位基因频率明显高于法国人群(P＜0.01),与印度和高加索人群相似。结论Apo CⅢ基因T-455C和C-482T的多态性在健康人群分布具有种族差异。

载脂蛋白CⅢ;基因多态性;聚合酶链反应;限制性片段长度;微流控芯片电泳

R541.4

A

(Chin J Lab Diagn,2010,14:0210)

载脂蛋白CⅢ(Apo CⅢ)由79个氨基酸残基组成,其分子量为8.8 KD,主要在肝脏中合成,小肠中也有少量表达。Apo CⅢ通过抑制脂蛋白脂肪酶(LPL)、肝脂酶(HL)以及受体活性影响血浆富含甘油三酯脂蛋白(TRL)的代谢。其基因定位于11q23,有4个外显子和3个内含子。由于Apo CⅢT-455C和C-482T这两个多态性位于启动子区的一个功能区域-胰岛素反应元件(IRE)(-490--449 bp)内,影响胰岛素对Apo CⅢ表达的负性调控作用,从而易引发高甘油三酯血症(HTG),而后者是冠心病(CHD)、动脉粥样硬化等疾病的独立危险因子。国外有许多学者对Apo CⅢ启动子区IRE内的T-455C和C-482T这两个多态性进行研究,但在不同种族人群中得出的结论不尽相同。本文研究中国南通地区汉族健康人群与不同种族人群的这两个多态性,比较其频率分布特征,为阐明Apo CⅢ基因多态性与HTG的关联性提供遗传和环境背景。

1 材料与方法

1.1 样本来源 74例健康人群来自南通大学附属医院体检中心,诊断标准为[1]:甘油三酯(TG)＜1.7 mmol/L、胆固醇(Tch)＜5.17 mmol/L,均排除肝、肾、甲状腺等疾病,其中女性37例,男性37例,年龄24-78岁,平均年龄40.49±10.5岁,均系南通地区、无血缘关系的汉族人群。

1.2 仪器与试剂 PTC-200型PCR扩增仪(MJ公司,美国)、Dolphin-Doc凝胶自动成像系统(WEALTEC,美国)、Caliper 1 000微流控电泳仪、微流控芯片、ME高分子胶(安捷伦,美国)、U-0080D核酸分析仪(日立,日本)、Taq DNA聚合酶购自上海生工(BBI分装)、限制性内切酶 BseGⅠ、MspⅠ(Fermentas)、dNTPs(南京生兴)、DNA 分子量标准φ X174DNA/HaeⅢ(立陶宛)、白细胞裂解液自制(10%SDS 10 ml,1 mmol/L Tris-HCl 5 ml,0.5 mmol/L EDTA 0.4 ml,加双蒸水至100 ml,高压灭菌,4℃保存)。Apo CⅢ上、下游引物自行设计,分别为:p1 5′GCACTCGCCTGCCTGGATT 3′,p2 5′TGAGTCCACGCTGCTGTCCC 3′,由上海生工公司合成及纯化。

1.3 基因组DNA抽提 从1 ml EDTA抗凝外周血中提取有核细胞,用蛋白酶K和白细胞裂解液消化,然后用酚/氯仿/异戊醇法抽提DNA,溶于适量TE缓冲液,-20℃保存备用。

1.4 核酸的扩增 每个PCR扩增体系为50 μ l。其中包括基因组DNA 100 ng,10×PCR 缓冲液5 μ l(100 mmol/L Tris-HCl,500 mmol/L KCl,0.8%Nonidet P40),200 μ mol/L dNTPs,MgCl22.0 mmol/L,上下 游引物各0.1 μ mol/L,1.5 μTaq DNA 聚合酶 。扩增条件:95℃预变性 3 min,94℃30 s、60℃40 s、72℃30 s,共33个循环,最后72℃延伸5 min。

1.5 产物鉴定及分析

1.5.1 -455位点用琼脂糖凝胶电泳方法 PCR产物用BseGⅠ于55℃消化2小时,3.0%琼脂糖凝胶中(含溴化乙锭0.5 μ g/ml)电泳 1小时,凝胶自动成像系统进行成像。

1.5.2 -482位点用微流控芯片电泳方法 PCR产物用MspⅠ于37℃消化3小时,进行微流控芯片电泳。

1.6 统计学处理 Apo CⅢ-455位和-482位基因频率及基因型频率用直接计数法,不同地区、不同人种Apo CⅢ基因频率的构成比用 χ2检验进行比较,所有数据统计由Stata8.0统计软件完成。

2 结果

2.1 Apo CⅢ基因多态性结果 用引物行PCR扩增反应可获得Apo CⅢ启动子区长度为413 bp的一段产物(图1)。

2.1.1 T-455C多态性基因型的判别 扩增产物经BseGI作用后(酶切位点为 5′GGATGNN ↓′3 或 3′CCTAC↑NN′5),产生三种酶切结果:(1)-455TT纯合子时,扩增的基因片段,含有BseGⅠ酶切位点,可被完全酶切为123 bp、290 bp两条区带;(2)-455TC杂合子时,产生不完全酶切,出现123 bp、290 bp、413 bp三条区带;(3)-455CC纯合子时,其PCR产物经BseGⅠ消化,不产生酶切,则电泳后只出现413 bp一条区带(图2)。

2.1.2 C-482T多态性基因型的判别 扩增产物经限制性内切酶MspI作用后(酶切位点为 5′C↓CGG′3或3′GGC↓C′5),产生三种酶切结果:(1)-482CC纯合子时,可见315 bp、82 bp和16 bp三条带;(2)-482TT纯合子时,可见331 bp和82 bp两条带;(3)-482CT杂合子时,则可见331 bp、315 bp、82 bp和 16 bp四条带。然而在对酶切产物进行微流控芯片电泳分型过程中,由于16 bp的核酸序列太短,与定量标记15 bp条带只相差一个碱基,因此两者很难分离开,但这并不影响结果的判定(图3)。

图1 Apo CⅢPCR扩增产物

图2 Apo CⅢ-455位酶切产物

图3 Apo CⅢ-482位酶切产物微流控芯片电泳图谱

2.2 不同种族健康人群Apo CⅢ基因及基因型频率比较

2.2.1 Apo CⅢ-455位 中国南通地区汉族健康人群Apo CⅢ-455CC基因型频率明显低于印度和哥斯达黎加人群(P＜0.01),而与高加索和法国人群相似;-455C等位基因频率也明显低于印度和哥斯达黎加人群(P＜0.01),与高加索和法国人群相似(表1)。

表1 不同种族人群Apo CⅢ-455位基因及基因型频率比较[n(%)]

2.2.2 Apo CⅢ-482位 中国南通地区汉族健康人群Apo CⅢ-482TT基因型频率明显高于法国人群(P＜0.01),与中国北京、中国浙江、印度和高加索人群相似,-482T等位基因频率也明显高于法国人群(P＜0.01),与中国北京、中国浙江、印度和高加索人群相似(表2)。

表2 不同种族人群Apo CⅢ-482位基因及基因型频率比较[n(%)]

3 讨论

Apo CⅢ基因定位于人类11号染色体,与Apo AⅠ、AⅣ基因紧密相连,共同组成一个基因家族。在转人Apo CⅢ基因小鼠中,血浆中Apo CⅢ过度表达并引起HTG[2],但可被apoE基因的过度表达所校正;在Apo CⅢ基因敲除的小鼠中,由于Apo CⅢ缺乏,不会引起餐后HTG[3];在动物和培养的细胞中Apo CⅢ基因表达可被胰岛素下调[4],从而使TG稳定在一定水平。IRE内基因突变体丢失了这个功能,导致Apo CⅢ基因对胰岛素的调节不反应。缺乏胰岛素调节会导致Apo CⅢ的过度表达并促进HTG的发展。但在对其IRE内多态性此两位点与TG的相关性研究中发现,不同种族人群中得出的结论不尽相同,如在加拿大人和法国女性[7]中观察到相关,在印度人群中更明显[5],而在荷兰的家族性混合HTG家系中并没有发现这种相关。但Olivieri[6]等研究了冠心病(CHD)和代谢综合症(MS)与T-455C多态性的关系并发现有相关性。Guettier[7]等也发现T-455C多态性与MS有相关性。Miller等建议将启动子区的这个多态性作为亚洲印度人群中预测CHD风险的标志物[8]。

本文研究中国南通地区汉族人群与不同种族人群的Apo CⅢT-455C多态性,发现中国南通地区汉族正常人群Apo CⅢ-455CC基因型频率明显低于印度[5]和哥斯达黎加人群[8](P＜0.01),而与高加索[5]和法国人群[7]相似;-455C等位基因频率也明显低于印度和哥斯达黎加人群(P ＜0.01),与高加索和法国人群相似。

C-482T位点,是Apo CⅢ基因启动子区另一多态性位点,国内外许多学者对其进行了研究。Talmud等[9]研究显示,Apo CⅢ基因C-482T多态性位点与血浆TG水平相关;Waterworth等[10]也证明Apo CⅢ基因C-482T多态性与血浆TG水平有相关性,且与吸烟有相互作用;Jaroslav等在捷克人群中发现,男性人群中-482T纯合子携带者具有较高的血浆TG水平。在加拿大人群与法国女性人群中也发现有这种相关性[7],在印度人群中尤其显著[5]。但国内学者毕楠等发现Apo CⅢC-482T位点多态性与冠心病无相关性[11],而李国平等在健康体检人群中却观察到Apo CⅢC-482T多态性与TG有相关性[12]。

本文研究发现,中国南通地区汉族健康人群Apo CⅢ -482TT基因型频率明显高于法国人群(P＜0.01),与中国北京[11]、中国浙江[12]、印度和高加索人群相似,-482T等位基因频率也明显高于法国人群(P＜0.01),与中国北京、中国浙江、印度和高加索人群相似。

本课题组已对Apo CⅢ基因启动子区多态性与HTG的相关性作了研究,并得出相关性结论[13,14],但由于-455位多态性在国内其他地区未见报道,因而无法在国内进行地区性比较,而-482位多态性在中国北京、中国浙江已有研究,其等位基因和基因型频率与本文无显著性差异,但明显高于法国人群。而由于病种和对象人群的选择标准不同,对患者组的基因频率和基因型频率则较难进行比较。

本文的研究结果与有些文献报道不同甚至相反,这种不一致有可能反映了遗传素质在种族间的差异,也在一定程度上解释了为什么不同种族HTG的发病率不一致。同时以上结果也说明,虽然存在种族差异及遗传背景的不同,Apo CⅢ基因多态性在不同种族HTG发病机制的遗传因素中均发挥着重要作用。这也在一定程度上解释了为什么印度人发生与脂质代谢混乱相关性疾病如冠心病(CHD)的概率高,是否与其-455C等位基因频率显著高于其他种族人群有关呢。携带有变异等位基因的所谓“健康人群”,若干年后是否会发病,发病的概率是多少呢,对这些进行跟踪研究很有意义。中国是多民族国家,研究不同民族人群基因多态性,可以尝试从基因角度解释为什么有些地区或民族患与脂质代谢混乱相关性疾病的概率高,这对高基因风险人群进行筛选,临床进行提前干预,对HTG和CHD等心血管疾病的预防具有积极意义。同时对研究不同种族人群的易患疾病进行分析研究打下一定基础。

以上结果分析表明,在分析Apo CⅢ基因多态性与疾病关联性时必须充分认识种族特异性对疾病易感性的影响。

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[13]俞 娟,王惠民,张志泉,等.载脂蛋白CⅢ基因T-455C多态性PCR-RFLP检测方法的建立及其应用[J].临床检验杂志,2007,25(4):276.

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Comparative study of polymorphism distribution of Apo CⅢgene between Chinese Han healthy population and different races

YU Juan,CHUShao-peng,YANGShu-mei,et al.(Laborotry Medicine Center,Affiliated Hospital of Nantong University,Nantong226001,China)

ObjectiveTo investigate the polymorphism distribution ofApo CⅢgene betweenChinese Han population and different races.MethodsDNA samples were extraced from 74 EDTA blood of unrelated healthy individuals.Apo CⅢalleles were typed using polymerase chain reaction-restrication fragment length polymorphism(PCR-RFLP)combining microfluidic chip electrophoresis.ResultsThe alleles frequencies of Apo CⅢ-455T was lower significantly in Chinese Han population than in the Indian and Costa Rica population(P＜0.01);The alleles frequencies of Apo CⅢ-482T was higher significantly in Chinese Hanpopulation than in the White race(P＜0.05).ConclusionThere exist ethnic difference in the distribution of Apo CⅢ-455C and-482T alleles in healthy individuals.

Apolipoprotein CⅢ;Genetic polymorphism;Polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism;Microfluidic chip electrophoresis

1007-4287(2010)02-0210-04

江苏省医学重点学科资助(XK200723),南通大学自然科学项目(08Z057)

*通讯作者,E-mail:ntfyjyk@pubnt.jsinfo.net

俞娟(1974-),女,医学硕士,主管技师,主要从事临床免疫学检验和分子生物学研究。

2009-01-16)