银杏叶提取物对糖尿病大鼠体内氧化应激的影响

任 明,任淑萍,杨淑娟,凌 翎,孙景春

(1.吉林大学公共卫生学院卫生毒理学教研室,吉林长春 130021;2.吉林大学中日联谊医院检验科,吉林长春 130021)

银杏叶提取物对糖尿病大鼠体内氧化应激的影响

任 明1,任淑萍1,杨淑娟1,凌 翎1,孙景春2*

(1.吉林大学公共卫生学院卫生毒理学教研室,吉林长春 130021;2.吉林大学中日联谊医院检验科,吉林长春 130021)

目的观察银杏叶提取物对糖尿病(D M)大鼠体内氧化应激水平的影响。方法利用Wistar大鼠建立糖尿病模型,将糖尿病大鼠分为糖尿病组(DM)和银杏叶治疗组(GBE),另设正常组动物为对照。D M组和正常对照组大鼠每日通过腹腔注射给予生理盐水0.83 ml◦kg-1,GBE组大鼠每日通过腹腔注射给予GBE 0.83 ml◦kg-1,连续注射30天后取血测定各组大鼠血清中丙二醛(MDA)含量和超氧阴离子(O2-)水平,然后取出胰腺、肾脏测定MDA含量并采用免疫组化S-P法(链霉素抗生物素蛋白一过氧化物酶)检测肾脏蛋白激酶C(PKC)的表达。结果与正常对照组相比,DM组和GBE组大鼠血清、肾脏和胰腺中MDA的含量及血清中超氧阴离子(O2-)的水平显著升高(P＜0.05);GBE组大鼠血清、肾脏和胰腺中MDA的含量及超氧阴离子(O2-)的水平显著低于DM组(P＜0.05)。免疫组织化学染色结果表明,D M组PKC表达显著强于GBE组。结论银杏叶提取物可减轻糖尿病大鼠体内的氧化应激水平,具有抗氧化作用,对糖尿病并发症的发生发展具有一定的预防作用。

银杏叶提取物;糖尿病;氧化应激

(Chin J Lab Diagn,2010,14:0199)

糖尿病是多种病因引起的以慢性高血糖为特征的代谢紊乱,是由于体内胰岛素绝对或相对不足或靶组织对胰岛素不敏感而引起的糖、脂肪、蛋白质代谢紊乱的疾病[1,2]。大量的研究发现氧化应激在糖尿病和糖尿病并发症的发生、发展过程中起到非常重要的作用。银杏叶提取物(GBE)是一种中药提取物,研究证实GBE具有抗氧化清除自由基活性[3],本文给予糖尿病大鼠GBE,观察银杏叶提取物对糖尿病大鼠体内氧化应激的影响。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂 银杏叶提取物注射液(德国威玛舒培博士药厂授权,台湾济生化学制药厂股份有限公司生产,银杏叶提取物含量为3.5 mg◦ml-1);STZ购自北京鼎国公司;MDA、超氧阴离子含量测定试剂盒(南京建成);PKC抗体(福州迈新公司);SP试剂盒(福州迈新公司)

1.1.2 实验动物 实验动物选用WISTAR雌性大鼠(清洁级),体重(200±20)g,由吉林大学实验动物中心提供。合格证号:(吉)2003-0007。

1.2 方法

1.2.1 糖尿病模型建立 实验用大鼠购回后饲养1周,观察期大鼠的一般状态,一般状态良好的用于实验。大鼠禁食12 h后,腹腔注射STZ,注射剂量为50 mg◦kg-1,正常组大鼠腹腔注射柠檬酸盐缓冲液,注射剂量为50 mg◦kg-1。注射STZ后,分别于注射第3、5、7日测定大鼠血糖,3次血糖测定值均高于16.7 mmo◦L-1的大鼠为糖尿病模型大鼠。

1.2.2 实验动物分组及治疗措施 糖尿病模型大鼠分为糖尿病组(DM)和银杏叶提取物治疗组(GBE),另设一组正常大鼠为正常对照组(C),每组10只。DM组和正常对照组大鼠每日通过腹腔注射给予0.83 ml◦kg-1的生理盐水,GBE组大鼠每日通过腹腔注射给予0.83 ml◦kg-1的GBE。连续给药30天。

1.2.3 检测血清中MDA和超氧阴离子的含量 按照试剂盒说明书的操作步骤进行操作并计算结果。

计算公式:MDA含量(nmol/ml)=(测定管的吸光度-空白管的吸光度)÷(标准管吸光度-标准空白管吸光度)×标准品浓度(10 nmol/ml)×样本测试前稀释倍数。超氧阴离子活力单位(U/L)=(测定管的吸光度-对照管的吸光度)÷(对照管的吸光度-标准管的吸光度)×标准浓度(0.15 mg/ml)×1 000 ml×样品测试前的稀释倍数。

1.2.4 检测组织中MDA的含量 按照试剂盒说明书的操作步骤进行操作并计算结果。

计算公式:MDA含量(nmol/mgprot)=(测定管的吸光度-空白管的吸光度)÷(标准管吸光度-标准空白管吸光度)×标准品浓度(10 nmol/ml)÷蛋白含量(mgprot/ml)。

1.2.5 组织中蛋白激酶C(PKC)的表达 PKC抗体检测采用免疫组化S-P法,按试剂盒说明书进行。结果评定:PKC表达阳性的细胞内出现棕色或棕黄色颗粒。根据光镜下观察阳性染色细胞的比例(5个高倍视野下的均数)分为:①阴性,染色细胞数＜10%;②阳性,染色细胞数在10%-50%;③强阳性,染色细胞数＞50%。

1.2.6 统计学处理 利用SPSS13.0统计软件进行统计分析,各组间测定指标比较用方差分析。

2 结果

2.1 GBE对糖尿病大鼠氧化应激指标的影响

连续给药30天后,与正常对照组相比,DM组和GBE组大鼠血清、肾脏和胰腺中MDA的含量及血清中超氧阴离子(O2-)的水平显著升高(P＜0.05);GBE组大鼠血清、肾脏和胰腺中MDA的含量及超氧阴离子(O2-)的水平显著低于DM组(P＜0.05),各组间具体的比较见表1、2。

2.2 肾脏组织中PKC表达的变化

经过30天的治疗后,GBE组PKC的表达率为32%,DM组PKC的表达率为58%。各组间PKC表达强度比较见图1。

表1 各组大鼠血清、胰腺、肾MDA含量的比较(±s)

表1 各组大鼠血清、胰腺、肾MDA含量的比较(±s)

注:*与正常组相比较,P＜0.05;#与DM组相比较,P＜0.05

Groups n 血清(nmol◦L-1)胰腺(nmol◦mg-1) 肾(nmol◦mg-1)Control 10 8.86±2.47 0.44±0.21 6.96±0.55 DM 10 16.85±1.64* 0.89±0.32* 9.72±0.37*GBE 10 10.23±2.42*# 0.70±0.27*# 8.53±0.45*#

表2 各组大鼠血清O2-活性的比较(±s)

表2 各组大鼠血清O2-活性的比较(±s)

注:*与正常组相比较,P＜0.05;#与DM组相比较,P＜0.05

Groups n O2-(U/ml)Control 10 64.59±15.43 DM 10 110.36±20.19*GBE 10 88.67±18.66*#

图1 各组大鼠肾组织中的表达PKC

3 讨论

糖尿病是当前威胁人类健康的严重慢性疾病之一。长期的高血糖引起全身多系统的代谢障碍,导致大血管和微血管的病变,出现严重的心、脑、肾、眼、神经等的并发症,严重影响糖尿病患者的生活质量,甚至危及生命[4]。在糖尿病的发生、发展过程中,氧化应激发挥了重要作用。本研究结果表明,糖尿病大鼠体内出现氧化应激,糖尿病大鼠体内的MDA、超氧阴离子水平显著升高,PKC表达增强。PKC是导致体内出现氧化应激的重要因素。PKC激活后可改变血管通透性,刺激血管增生,促进粘附因子表达以及导致ROS的过多生成[5]。银杏叶提取物通过其抗氧化活性,降低了糖尿病大鼠体内的MDA和超氧阴离子水平,减弱了PKC的表达,缓解了糖尿病大鼠体内的氧化应激状况,预防了糖尿病的进一步恶化,对预防并发症的发生起到一定的作用。本研究的结果提示,银杏叶提取物可以作为糖尿病治疗的辅助治疗手段。

[1]AC Maritim,RA Sanders,JB Watkins.Diabetes,Oxidative Stress,and Antioxidants:A Review[J].J Biochem Molecular Tocicology,2003,17(1):24.

[2]P Newsholme,EP Haber,SM Hirabara,et al.Diabetes associated cell stress and dysfunction:role of mitochondrial and non-mitochondrial ROS production and activity[J].J Physiol,2007,583(1):29.

[3]黄 璞,刘力强,韩 勇,等.银杏叶提取物对中枢神经系统药理作用的研究进展[J].中国医院药学杂志,2005,25(6):553.

[4]Reynolds K,He J.Epidemiology of the metabolic syndrome[J].Am J Med Sci,2005,330(6):273.

[5]M Meier,J Menne,H Haller.Targeting the protein kinase C family in the diabetic kidney:lessons from analysis of mutant mice[J].Diabetologia,2009,52(5):765.

Effects of Ginkgo Biloba Extract on the Oxidative Stress in Diabetic Rats

REN Ming,REN Shu-ping,YANGShu-juan,et al.(Department of Hygienic Toxicology,School of Public Health,Jilin University,Changchun130021,China)

ObjectiveTo explore the effects of Ginkgo Biloba extract on the oxidative stress in diabetic rats.MethodsWistar rats were used to establish diabetic model rats,and the diabetic model rats were randomly classified into diabetic group in which the rats were administered saline intraperitoneally at the dose of 0.83 ml◦kg-1,and GBE group in which rats were administered GBE intraperitoneally at the dose of 0.83 ml◦kg-1.Normal ratswere used as normal control.After 30 days,the serum in rats from different groupswere collected to test the level of superoxide anion and malondialdehyde,the expression of protein kinase C(PKC)in kidney was alsto determined.ResultsThe level of MDA and superoxide anion in rats from diabetic group was significantly higher than those from normal control and GBEgroup.The expression ofPKC indiabetic ratswas stronger thanthat inGBE rats.ConclusionGBE can attenuate the oxidative stress in diabetic rats and play a role in the prevention of diabetic complicaiton development.

Ginkgo Biloba extract;diabetes mellitus;oxidative stress

R587.1

A

1007-4287(2010)02-0199-03

吉林省中医药管理局课题(08sys-063);吉林省卫生厅课题(20089010)

*通讯作者

2009-04-17)