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血清卵泡抑素水平检测用于卵巢癌诊断的研究

2010-08-21陈芳芳王轶楠孟小丹柳忠辉

中国实验诊断学 2010年2期
关键词:卵巢癌卵泡外周血

陈芳芳,王轶楠,汪 丽,孟小丹,孙 洋,柳忠辉*

(1.吉林大学白求恩医学院免疫学教研室,吉林省神经免疫与临床免疫重点实验室,长春 130021;2.吉林大学中日联谊医院)

血清卵泡抑素水平检测用于卵巢癌诊断的研究

陈芳芳1,王轶楠1,汪 丽2,孟小丹1,孙 洋1,柳忠辉1*

(1.吉林大学白求恩医学院免疫学教研室,吉林省神经免疫与临床免疫重点实验室,长春 130021;2.吉林大学中日联谊医院)

目的探讨卵泡抑素在卵巢癌患者血清中的水平变化及其临床意义。方法采用ELISA法检测肿瘤患者及健康对照者血清FS水平;免疫组织化学染色观察卵巢癌组织FS表达情况。结果卵巢癌患者血清FS水平明显高于健康对照组,统计学比较差异显著,P<0.01;乳腺癌和肺癌患者血清FS水平也高于健康对照组,P<0.05;胃癌和肾癌患者血清FS水平与健康对照组比较无显著性差异,P>0.05。肿瘤诊断阳性率依次为卵巢癌(60%)>乳腺癌(40%)>肺癌(30%)>胃癌(20%)>肾癌(0%)。免疫组织化学染色显示,卵巢癌组织表达FS与肿瘤类型有关,染色强度依次为粘液性癌>子宫内膜样癌>透明细胞癌>鳞癌>浆液性癌。结论卵巢癌患者血清FS水平升高,其诊断阳性率与卵巢肿瘤类型有关;血清FS检测对卵巢癌诊断具有重要价值。

卵泡抑素;酶联免疫吸附试验;卵巢癌;诊断

(Chin J Lab Diagn,2010,14:0207)

卵泡抑素(Follistatin,FS),又称激活素结合蛋白,是一种单链糖蛋白,最初从猪和牛的卵泡液中分离获得,具有抑制垂体前叶腺细胞分泌卵泡刺激素(FSH)作用[1,2]。对FS的生物学活性及其与疾病的关系研究发现,FS作为激活素特异结合蛋白参与体内多种生理、病理功能的调节,如在早期胚胎发育、卵巢颗粒细胞分化、肝纤维化、多卵巢综合征等疾病的形成中均具有重要的作用[3,4]。FS不仅在性腺组织表达,在外周血中也能检测到FS成熟蛋白的分泌,血清中FS水平变化与女性妊娠以及肿瘤等有关[5,6]。为了明确FS与卵巢肿瘤的关系,本研究通过检测卵巢癌患者外周血FS水平变化,以及FS在卵巢癌组织中的表达,进而阐述FS在临床诊断卵巢癌中的意义。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 FS标准蛋白来自中国仓鼠卵巢细胞(CHO)表达的重组人FS288,由日本德岛大学新谷保实先生提供。

1.2 研究对象 选择自2005年1月至2007年6月在吉林大学第一、二临床医院住院的经病理和细胞学诊断证实的肿瘤患者(卵巢癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、肾癌)。

1.3 血清样本处理 血清采自患者入院后第二日晨时空腹静脉血,经3 000 r/min离心10分钟,分离血清,-80℃保存待测。对照组血清来自吉林大学第一医院体检中心体检的健康女性血清,-80℃保存待用。

1.4 ELISA法检测血清FS 采用FS双位点ELISA[7],简言之,利用0.05 mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液稀释鼠抗Follistatin单抗至2.5 μ g/ml,包被96孔酶标板,每孔100 μ l,4℃过夜。次日,以洗液洗板一次,1%BSA于37℃封闭1小时,弃封闭液,洗板三次,每孔加100 μ l样本稀释液稀释的标准FS蛋白(0.25-16 ng/ml)或样本。37℃孵育1小时,洗板三次,每孔加100 μ l的兔抗FS 多抗(1∶500),37℃孵育1小时,洗板三次,每孔加 100 μ l酶标羊抗兔IgG抗体(1∶1 000)。37℃孵育1小时,洗板三次,每孔加100 μ l邻苯二胺(OPD)底物缓冲液,室温避光显色5分钟,每孔加50 μ l 2 mol/L H2SO4终止反应。酶联免疫测定仪测490 nm光吸收值(A490 nm),绘制标准曲线,通过标准曲线计算样本中FS含量。

1.5 免疫组织化学染色观察FS在卵巢癌组织中的表达 采用石蜡组织切片,经常规脱腊、抗原修复后浸入到0.01 mol/L pH7.4 PBS中漂洗3×5分钟,加入3%H2O2-甲醇液处理30分钟,封闭细胞内源性过氧化物酶。浸入到0.01 mol/L pH7.4 PBS中洗3×5分钟。0.25%TritonX-100-5%DMSO(二甲亚枫)溶液中孵育10分钟渗透细胞膜,再浸入到0.01 mol/L pH7.4 PBS中洗3×5分钟。滴加2%牛血清白蛋白(BSA),室温湿盒中封闭30分钟,以防止非特异性吸附。滴加鼠抗FS单克隆抗体[6],湿盒内4℃孵育过夜,浸入到0.01 mol/L pH7.4 PBS中洗3×5分钟。采用SP检测试剂(福建迈新公司产品),按说明书操作,DAB显色,苏木精染料复染,常规梯度酒精脱水干燥,二甲苯透明,树胶封片,光学显微镜观察染色结果。

2 结果

2.1 肿瘤患者外周血FS水平变化 采用双位点ELISA法检测健康成年女性(30例)及不同肿瘤患者(各20例)外周血中FS水平。结果如图1所示,卵巢癌患者外周血FS水平与健康对照组比较差异显著,P<0.01,肺癌、乳腺癌外周血FS水平与健康对照组比较也有差异,P<0.05。肾癌和胃癌患者外周血FS水平与健康对照组比较无显著差异,P>0.05。

图1 ELISA法检测不同肿瘤患者及健康对照者外周血FS结果

2.2 肿瘤患者外周血FS检测阳性率 以大于健康女性对照组¯x+2.5 s为阳性,分析各组肿瘤患者FS升高阳性率,结果如图2所示,阳性率依次为卵巢癌(60%)>乳腺癌(40%)>肺癌(30%)>胃癌(20%)>肾癌(0%)。

2.3 FS在不同类型卵巢癌组织的表达情况 采用抗FS单克隆抗体进行免疫组织化学染色结果如图3显示,不同病理类型的卵巢癌抗FS抗体染色强度不同,依次为粘液性癌>子宫内膜样癌>透明细胞癌>鳞癌>浆液性癌。该结果进一步认证了卵巢癌患者血清FS水平并不是全部升高的原因。

图2 检测不同肿瘤患者外周血FS阳性率

图3 免疫组织化学染色检测卵巢癌组织FS表达结果

3 讨论

卵巢癌是女性生殖器官常见肿瘤之一,因其早期无症状,多数发现时即是晚期,死亡率高,因此卵巢癌诊断一直是临床上的难题。FS与激活素的相互作用共同调控卵巢排卵和卵巢损伤上皮的修复与细胞增殖,FS与激活素共同存在、共同表达构成一个维持卵巢正常生长的平衡系统,其中一项的过度表达或另一项的减少引起的激活素-FS系统的失衡,将伴随卵巢生理过程的失调和病理过程的形成。而激活素具有很强的刺激细胞增殖的作用,其长期过量的表达可能是诱导或促进癌肿发生的因素之一,实验研究发现作为激活素特异结合蛋白的FS虽然不能消除这种小鼠肿瘤的发生,但可显著延长生存期[8]。本研究显示卵巢癌患者外周血FS水平升高,很有可能是作为激活素结合蛋白、其过量表达是机体为了抑制卵巢癌生长的主动的生理性反应。本实验研究还提示,FS的升高在检测的数种肿瘤中,以卵巢癌的升高最明显,阳性率也最高,因此,外周血FS水平检测有可能成为一种有效的临床辅助诊断卵巢癌的肿瘤指标。

为了阐述卵巢癌患者外周血FS水平升高以及并不是全部卵巢癌患者外周血FS检测结果均阳性的原因,实验采用抗FS单克隆抗体对不同病理类型的卵巢癌进行免疫组织化学染色。结果发现不同病理类型卵巢肿瘤表达FS的水平不同,依次为粘液性癌>子宫内膜样癌>透明细胞癌>鳞癌>浆液性癌。该结果表明,卵巢癌患者外周血FS水平升高可能来源于卵巢癌组织产生的FS,但并不是所有卵巢癌组织均能高表达FS,这也进一步解释了卵巢癌患者外周血FS水平测定结果并不是全部升高的原因。

综上所述,本研究证实,具有广泛组织分布,参与多种生物学作用的FS在卵巢癌患者外周血中高表达,其升高水平与卵巢癌组织类型有关,外周血FS水平测定对卵巢癌的临床诊断具有一定的辅助诊断意义。

[1]Robertson D M,Klein R,de Vos FL,et al.The isolation of polypeptides with FSH suppressing activity from bovine follicular fluid which are structurally different to inhibin[J].Biochem Biophys Res Commun,1987,149(2):744.

[2]Ueno N,Ling N,Ying S Y,et al.Isolation and partial characterization of follistatin:a single-chain Mr 35,000 monomeric protein that inhibits the release of follicle-stimulating hormone[J].Proc Natl Acad Sci USA,1987,84(23):8282.

[3]Maguer-Satta V,Bartholin L,Jeanpierre S,et al.Regulation of human erythropoiesis by activin A,BMP2,and BMP4,members of the TGFbeta family[J].Exp Cell Res,2003,282(2):110.

[4]Nakamura T,Hasegawa Y,SuginoK,et al.Follistatin inhibits actvin-induced diffrenciation of rat follistatin grannulosa cells in vitro[J].Biochem Biophys Acta,1992,1135:103.

[5]Wakatsuki M,Shintani M,Abe M,et al.Immunoradiometric assay for follistatin:Serum Immunoreactive follistatin level in normal adult and pregnant women[J].J Clin Endocrinol Metab,1996,81:630.

[6]Liu Z H,Shintani Y,Sakamoto Y,et al.Effects of LHRH,FSH and activin A on follistatin secretion from cultured rat anterior pituitary cells[J].Endocrine J,1996,43:321.

[7]董 辉,汪 丽,韩宏伟,等.两种卵泡抑素免疫检测方法的比较[J].中华检验医学杂志,2002,25(6):342.

[8]Farrell W E,Clark AJL,Stewart M F,et al.Bromocriptine inhibits Proopiomelanocortin mRNA and ACTH precursor secretion in small cell lung cancer cell lines[J].J Clin Invest,1992,90:705.

Study of the application of serum follistatin detection on the diagnosis of ovarian cancer

CHEN Fang-fang,Wang Yi-nan,Wang Li,et al.(Department of Immunology,Norman Bethune College of Medical Sciences,Jilin University,Changchun130021,China)

ObjectiveTo investigate the change of levels of serum follistatin(FS)in ovarian cancer patients and its clinical significance.MethodsSerum FS levels in patientswith cancer and healthy controlswere examined by ELISA;FS expression in tissues of ovarian cancer was assayed by immunohistochemical staining.ResultsThe serum FS levels in patients with ovarian cancer were significantly higher than that in healthy control group,which has statistical significance(P<0.01).Serum FS levels in breast and lung cancer patientswere also higher than healthy control group(P<0.05),but serum FS levels in stomach cancer and kidney cancer patients showed no difference with healthy controlgroup(P<0.05).The positive rate of cancer diagnosis was showed as follows:ovarian cancer(60%)>breast cancer(40%)>lung cancer(30%)>gastric cancer(20%)>renal cell carcinoma(0%).Immunohistochemical staining results showed that expression levels of FS in ovarian cancer were related to tumor types,and the staining intensity was as follows:mucinous carcinoma>endometrioid carcinoma>squamous carcinoma>clear cell carcinoma>serous cystadenocarcinoma.ConclusionSerum levels of FS are increased in ovarian cancer patients and the positive rate of diagnosis are related to the type of ovarian cancer.Therefore,detection of serum FS levelsmaybe hasgreat potential in the diagnosis of ovarian cancer.

book=208,ebook=110

follistatin;enzyme-linked immunosorbent assay;ovarian cancer;diagnosis

1007-4287(2010)02-0207-03

吉林省杰出青年基金项目(4-20-5)

*通讯作者

R737.31

A

2009-05-16)

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