一株产肠毒素金黄色葡萄球菌致死小鼠的初步研究

刘富来，冯翠兰

（佛山科学技术学院，广东佛山 528231）

1 材料与方法

1.1 金黄色葡萄球菌和小鼠

金黄色葡萄球菌菌株（SEF101）由本校食品科学实验室从典型病例中分离，金黄色葡萄球菌检测参照《食品卫生微生物学检验》GB/T4789.10-2003进行[3]和 VIDAS法肠毒素实验，鉴定为产肠毒素金黄色葡萄球菌。18-22日龄KM小鼠（SPF级），雌雄各半，由广东省医学实验动物中心提供，许可证号SCXK(粤)2003-002，粤监证字2008A022。实验前置室内适应环境7天，室温20-29℃，采用架式笼养，标准饲料，饮水为自来水，实验前禁饲12小时。

1.2 仪器和试剂

全自动荧光/化学发光分析仪(SpectraMax M2e)，Molecular Devices生产；YLN-30电脑控制菌落计数器，北京亚力恩科学器材公司生产；葡萄球菌肠毒素SET检测试剂盒，上海博舜生物科技有限公司提供。普通营养琼脂、高盐甘露醇琼脂(SP)和营养肉汤培养基。显微镜，培养皿。

1.3 感染菌液的制备

挑取生长在SP平板上的金黄色葡萄球菌菌株（SEF101）单菌落，接种于5mL营养肉汤中37℃摇振(100r/min)培养20h，然后将陈旧菌液加入45mL新鲜营养肉汤培养基中继续培养24h，收集培养物，同时采用平板表面涂布法和YLN-30电脑控制菌落计数器进行活菌计数，计算实际含菌量，确定所收集培养物含菌量为6.6×109CFU/mL，将肉汤分为A、B两份，A=10mL，B=40mL。

1.3.1 不同稀释度肉汤制备

按10倍稀释法将肉汤A作10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6不同稀释度稀释，备用。

1.3.2 细菌灭活处理

肉汤B再分为两等份，把其中一份于80℃灭菌30min，另一份不作处理，可得不灭活的肉汤培养物和灭活的肉汤培养物各1份。将灭活处理后的肉汤，以平板划线培养24h不长菌为标准检验灭菌效果。

1.4 酶标免疫法检测肠毒素

严格按全自动荧光/化学发光分析仪的操作规程进行上机检测肉汤B的2份培养物，采用全自动酶标免疫测试系统以荧光酶联免疫技术检测其肠毒素。

“千淘万漉虽辛苦，吹尽狂沙始到金”，以大道之行、天下为公为使命，在历史上镌刻下一个个不可磨灭的青春印记。先行者青春之信念和青春之行动，奔腾于历史，涌动于血液，传承于后人，传承于石化。

1.5 动物分组及感染

1.5.1 金黄色葡萄球菌致死小鼠实验

将77只小白鼠称重标记，随机分为7组，每组11只，1-6组为实验组，依次为第1组肌注不灭活的菌液，第2组肌注经灭活处理的菌液，第3组腹腔注射不灭活的菌液，第4组腹腔注射经灭活处理的菌液，第5组尾静脉注射不灭活的菌液，第6组尾静脉注射经灭活处理的菌液，用肉汤B菌液，每只鼠染菌剂量为0.5 mL；第7组为对照组，肌注0.5mL灭菌生理盐水。

1.5.2 腹腔注射感染剂量实验

将77只小白鼠称重标记，随机分为7组，每组11只，1-6组为实验组，分别经腹腔注射接种10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6不同稀释度的肉汤A菌液0.5mL，第7组为对照组，腹腔注射0.5mL灭菌生理盐水。

1.6 样本的采集及处理

感染后每隔4h观察1次，观察7d，观察发病鼠的精神状态和外观体况并记录鼠的发病、死亡情况，作好统计、整理；及时剖杀死鼠，观察其组织器官的病理变化；无菌取病死鼠的心脏、肝脏和肾脏等组织涂片、触片，革兰染色镜检，同时用SP进行选择培养；试验结束时扑杀所有剩余的鼠，取试验组及对照组小鼠的心脏、肝脏和肾脏等组织器宫，以中性甲醛固定，按常规方法制作组织切片，H·E染色，观察病理组织学变化。

1.7 死亡鼠细菌鉴定

感染动物死亡后，用无菌方式采取动物的内脏制作触片，自然干燥后革兰氏染色，镜检。

2 结果与分析

2.1 肠毒素检测结果

肠毒素检测结果见表1。所有肉汤B肠毒素检测均呈阳性反应，表明金黄色葡萄球菌菌株（SEF101）肉汤培养24h可产生肠毒素。

2.2 小鼠死亡情况

2.2.1 金黄色葡萄球菌致死小鼠实验

各组小鼠死亡时间和数量的情况见表1。经灭活处理的肉汤培养物，致小鼠死亡集中在两天内，说明金黄色葡萄球菌（SEF101）在培养过程中产生了一些可致小鼠死亡的物质；不经灭活处理肉汤培养物，可致全部小鼠死亡，呈第1天和第3天两个死亡高峰，初步猜测前一个高峰为培养物中致死物质直接导致小鼠死亡，后一个高峰为细菌感染小鼠后引起死亡。

2.2.2 腹腔注射感染剂量实验

各稀释度小鼠死亡情况见表2。稀释度＜10-4即可引起小鼠感染死亡，原培养物含菌量为6.6×109CFU/mL，每只腹腔注射菌液0.5mL，表明每只小鼠染菌量＞3.3×105CFU即可引起小鼠感染死亡。

2.3 细菌鉴定

经灭活处理的肉汤培养物所致死小鼠内脏未分离到接种菌；未经灭活处理的各组死亡鼠均分离大量均匀一致，单个、成对或不规则排列成葡萄串状的革兰氏阳性球菌，特征与所接种的病原菌一致，说明金黄色葡萄球菌（SEF101）可感染小鼠并致小鼠死亡。

2.4 临诊症状

病鼠初期大多表现精神不振，采食、饮水减少，部分病鼠蜷缩于一角。病情加重后，病鼠呼吸困难，颜面部发绀，接种处皮下呈青紫色。后期病鼠极度衰弱，接种处出现化脓性病变，病鼠相互拥挤在一起不愿活动，最后衰竭死亡。对照组鼠未见异常症状。

2.5 剖检病变

病鼠各组织器官出现广泛病变。肺淤血、水肿；肝脏淤血、肿大；脾脏肿大、坏死，在表面和切面上可见多个大小不等的坏死灶；肾脏肿大、色淡；胃粘膜水肿增厚，粘膜下或表面出现脓性溃疡灶；肠系膜和浆膜的小血管扩张、充血，肠粘膜有小的出血点或出血斑。对照组鼠肉眼未见异常病变。

2.6 病理观察

各组死亡小鼠，病理变化差异不大，脾脏呈明显肿大。肝脏肿大，肝细胞颗粒变性、肿胀，见图1至图2。心脏、肾脏和肺脏也有不同程度病变。

3 讨论

本研究试图通过80℃灭菌30min处理金黄色葡萄球菌（SEF101）肉汤培养物，与未经处理的培养物比较，观察接种小鼠的死亡情况，判断该菌能否产生对小鼠致死的毒素。结果表明，金黄色葡萄球菌（SEF101）能产生导致小鼠死亡的毒素，所有培养物VIDAS法检测呈肠毒素阳性，可以肯定该菌能够产肠毒素，但本研究并未对肠毒素类型进行鉴定。

经典的肠毒素动物学试验方法是采用幼猫和猴作为研究对象，腹腔注射或喂食肉汤培养物或呕吐物，然后观察动物可能出现的各种异常的生理或形态变化，一般4h内受试动物发生呕吐腹泻和体温升高或死亡等现象者，提示SE存在。小鼠、家兔、猪、狗等其他动物均对SE不敏感或感应性差，无特异性，实用价值低[4]。本研究的结果与上述观点不同，从实验结果看，小鼠对金黄色葡萄球菌（SEF101）比较敏感，最小染菌剂量为每只小鼠染菌量＞3.3×105CFU即可引起小鼠感染死亡。人工接种后具有明显的临床症状和病理学变化，说明小鼠可作为金黄色葡萄球菌感染的实验动物，这给制备动物模型进行临床治疗药物的筛选提供了良好的动物模型，为进一步探讨金黄色葡萄球菌的致病机理及疫苗的研制奠定了重要的实验基础。

综上所述，小鼠对金黄色葡萄球菌高度敏感，最小染菌剂量为＞3.3×105CFU/只，小鼠可作为金黄色葡萄球菌感染的实验动物；金黄色葡萄球菌（SEF101）肉汤培养24h可以产生致死小鼠的毒素，这些毒素经80℃30min处理仍具有活性，毒素中含肠毒素；金黄色葡萄球菌（SEF101）所产生的肠毒素类型有待进一步研究。

[1]张严峻，张俊彦.金黄色葡萄球菌肠毒素基因的分型和分布[J].中国卫生检验杂志，2005，15(6):682-684.

[2]张雯霞，陈敏，席曼芳，等.金黄色葡萄球菌肠毒素实验分析 [J].上海预防医学杂志，2008，20(4):186-188.

[3]GB/T4789.10-2003食品卫生微生物学检验[S].北京：中国标准出版社，2003.

[4]杨彩娟，蒋志勇，陈德坤，等.猪葡萄球菌感染裸鼠及BALB/c小鼠模型的研究 [J].中国动物检疫，2008，25（5）：26-28.