相关分子在哺乳动物原始卵泡启动和生长中的作用＊

1 卵泡生长启动的早期指标

哺乳动物中,原始卵泡池根据物种不同是在胎儿或新生儿时期建立起来的[2]。一旦这个原始卵泡池建立起来,原始卵泡就开始随着卵泡的启动或原位凋亡而减少。由于原始卵泡从来不会补充更新,所以它最终将枯竭,通常发生于中年后[3]。卵泡的激活是指卵泡从非活动期(原始卵泡)向活动期(初级卵泡)转化。此时,卵细胞开始增大,GC开始增殖。紧接着在生长的卵细胞和GC间出现透明带,并在初级卵泡期较为明显[4-5]。但形态学变化可能是早期生化改变的结果,因此可以探索一种非常灵敏的、能广泛应用的指标来鉴别卵泡生长的早期启动过程。

增殖细胞核抗原(PCNA)是一个35KD的核蛋白,并且在整个细胞周期里发挥重要的作用[6]。在S期时,PCNA伴随着另一种细胞增殖的重要调节因子周期素D(cylin D)出现[7],这个复合体由多种生长因子和其它的生长刺激所调节。如果细胞在G1期接受了合适的刺激,就将进入S期,PCNA表达在G1/S期增加,在G2期达到稳定,在M期和静止期急剧下降。这些特性决定了PCNA成为非常有用的细胞增殖的指标。

PCNA表达量的增加与GC生长早期标志一致,在卵泡生长早期即细胞增大之前,卵细胞便开始表达PCNA。随后的卵泡生长期里,GC和TC普遍具有PCNA免疫活性,随卵泡闭锁程度的加深而下降,原始卵泡的细胞没有PCNA表达,因此PCNA免疫活性并不比从形态上可检测到的卵泡生长启动优先。然而,在卵泡生长的最早期阶段,PCNA开始在GC中表达,甚至在许多并没有明显增大标志的细胞里表达。但也有些在生长最早期的GC虽然已明显增大,却不表达PCNA,可能因为这些细胞正处于M期,此期PCNA表达急剧下降。尽管也有一些不尽如人意的结果,PCNA免疫活性仍不失为卵泡生长启动的早期指标。

2 调控原始卵泡生长启动的因素

原始卵泡是由一层扁平的卵泡细胞和一个未分化的卵母细胞组成,其生长启动可分为两个阶段,首先卵泡细胞由扁平变成立方形,开始增殖,此过程与卵泡抑素(follistatin)的表达同步发生;随后卵母细胞开始生长,并伴有GC数的增加及功能的分化[8-9]。由此看来,卵泡细胞的生长分化是原始卵泡生长、启动的关键。近年来的研究发现,主要有以下几种因子调控原始卵泡的生长启动。

2.1 FSH及其受体(FSHR)

通常认为卵泡发育是通过垂体促卵泡生长激素(FSH)调控的。但有报道指出,FSH从原始卵泡直至晚期窦前或早期窦状卵泡分化过程中并不起决定性作用,敲除FSH基因的小鼠,其卵泡亦能发育至多层GC的窦前阶段[10]。由此提示我们,FSHR在原始卵泡启动的初期不必需,但在卵泡的后期发育中却是不可忽视的。在恒河猴中,一旦卵泡直径达到1mm,此时若没有充足的FSH供给,卵泡将退化。一旦卵泡启动生长,FSH能刺激窦前卵泡GC的生长和分化,并分泌某种因子,该因子又可刺激 TC的分化,TC能分泌多种生长因子,从而刺激卵泡的进一步发育。

2.2 LH及其受体(LHR)

LHR分化较迟,FSH通过其 GC受体与卵泡内源的雌二醇、IGF-I以及激动素等的协同作用诱发GC上LHR出现,这是形成优势卵泡的关键,但L HR对原始卵泡生长启动的研究很少。Flaw s J A等[11]通过对转基因小鼠的观察发现,转有LH亚基的小鼠卵巢在产后三周内,卵泡的形态与正常小鼠相似。但五周后,正常小鼠中健康的原始卵泡、初级卵泡和大的窦前卵泡的数目与闭锁的卵泡同样多,而转基因的小鼠卵巢中有充血的窦,形态不佳的GC,黄体化的细胞,以及比正常少45%的原始卵泡。三个月后,转基因小鼠的原始卵泡比正常的低68%,初级卵泡低53%。由此可以推测,L H除对发育中的卵泡有更进一步的作用外,长期缓慢地提高LH水平能耗尽原始卵泡池,加速生殖衰老的开始。

2.3 IGF-I

Hammond发现猪卵泡液中含有IGF-I,在性腺甾体和促性腺激素的作用下[12],由GC分泌。用eCG处理青春前期的雌性小猪,注射剂量可有效刺激卵泡生长,能在24小时内提高卵泡液中IGF-I的浓度, 72小时达到最大水平。而在此过程中血清IGF-I水平未见增加。这表明卵泡液IGF-I水平的提高是卵泡内源的,并非从血清中摄取的。从而进一步证实在促性腺激素介导卵泡生长过程中,IGF-I以卵巢内旁分泌或自分泌机制发挥作用。

2.4 EGF/TGF-α

体外研究发现,无论FSH存在与否,EGF都能刺激卵细胞-GC复合体的生长[13-14];不管有无IGF -I存在,EGF可促进卵丘细胞的扩展,而有无 EGF,IGF-I都可促进未成熟卵细胞的成熟;FSH和LH能增加EGF结合到GC上的能力,但并不改变其受体结合亲和性[15]。这些研究表明EGF对卵泡发生有重要作用。它通过刺激FSHR表达和孕酮产生;抑制FSH诱导的LHR分化、抑制素分泌和芳香化酶活性;以及促进GC中tPA活性等,调节卵巢GC的生长和分化。在生长期,EGF作为抗原因子诱导 GC增殖;在窦状卵泡期,调节GC分化和卵细胞成熟等。正如促性腺激素调节甾体发生机制一样,EGF可能通过调控tPA的活性来影响排卵或黄体化。

2.5 bFGF

原始卵泡的卵母细胞已证实产生碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、生长分化因子-9(GDF-9),并作用于邻近的体细胞,促进原始卵泡生长,能使初级卵泡发育至小窦前卵泡阶段[16-17];bFGF m RNA和其蛋白均定位于大鼠膜细胞[18]。与EGF和IGF-I的作用相反,它明显减弱GC中由FSH介导的LH受体合成和芳香化酶活性。然而,对仓鼠的窦前卵泡而言,bFGF能刺激3H胸腺嘧啶掺入,但与EGF或IGF -I相比此作用较小。它能明显降低培养的大鼠膜细胞中hCG-介导的雄二酮产生,而且抑制P-450活性。FSH可通过蛋白激酶C机制,刺激cAM P依赖的蛋白激酶调节亚基(RII)增多,但bFGF能减弱FSH的这种作用。近年来发现,bFGF对大鼠卵细胞成熟有一定的作用。它通过大鼠 GC刺激cAM P产生,并诱导tPA表达。在不同浓度范围下,bFGF可诱导10-80%的卵细胞生发泡破裂,并刺激相同卵泡的前列腺素产生。这些发现表明,bFGF能模拟某种LH的重要功能。但其是否是LH调节卵泡功能的一部分有待进一步的研究。

2.6 TGFβ1/TGFβ2

Levacher等发现,大鼠从胎儿第14.5天直至整个胎儿期在某些体细胞里都有TGFβ1和TGFβ2的轻微表达,在出生后第一天的GC中也有表达。TGFβ1在老龄大鼠的原始和初级卵泡的GC中表达下降,而TGFβ2持续存在。在次级和小窦状卵泡中TGFβ1消失,TGFβ2微弱表达。出生后十四天的大鼠卵巢里,新形成的功能性TIC可中等程度地表达TGFβ2,但能较强地表达TGFβ1。

hibin和Activin属于TGF-β超家族成员。Inhibin由α亚基与两个β亚基(即βA或βB)通过二硫键连接形成两种具有生物学活性的二聚体,即Inhibin A(α-βA)和Inhibin B(α-βB)。α,βA和βB三个亚单位是由不同的编码产生的三种不同的多肽分子。β亚单位βA和βB相互组合通过二硫键连接形成三种不同形式的具有生物活性的二聚体,即Activin A(βA-βA),Activin B(βB-βB)和Activin AB(βA-βInB)。Follistatin是由单个基因编码的富含半胱氨酸的单链糖蛋白,不属于转化生长因子β(TGF-β)超家族成员,Follistatin通过与Activin的β亚基相连阻断其与受体的作用,从而抑制了Activin的生理作用;Fo llistatin虽然也与Inhibin结合,但其亲和系数较低,起不到抑制 Inhibin的作用。离体实验证明, Activin可促进GC增殖和分化。敲除小鼠Activin II型β受体,卵泡发育受阻于早期阶段;有报道指出, Activin促进小卵泡GC的FSH受体形成和P450芳香化酶活性,从而增加 GC雌激素的产生。抑制素也可通过促进雄激素分泌,间接地增加卵泡雌激素的分泌量,促进可分泌雌激素的卵泡被优势选择[19]。随着优势卵泡的进一步发育,卵泡抑制素和雌激素分泌增加,进而降低FSH的分泌水平,并且优势卵泡还会分泌Inhibin以旁分泌方式作用于周围卵泡,使得未被优势化的卵泡成熟发育受阻,以此参与卵泡选择[20-21]。

2.7 TNF-α

Kondo等发现,TNF-α在人胎儿和成年的卵巢中表达,但随卵泡发育不同时期其表达位点有变化。在原始卵泡中,TNF-α主要出现在原始卵泡的卵细胞上;在窦前卵泡主要位于 GC,窦状卵泡位于TIC,在排卵前卵泡又开始出现在卵细胞上,并且随卵泡的发育成熟而增高;在中期黄体的颗粒和膜黄体细胞中也存在有TNF-α,退化黄体中随着黄体退化程度的增加,TNF-α表达量下降;闭锁卵泡的早期阶段里卵细胞中只有微弱TNF-α表达,GC和TC仍有中等程度的表达,晚期阶段里 GC上无表达,TC上仍有表达。这些研究结果表明,卵巢内卵细胞是TNF-α的初级位点,而且TNF-α可能参与了卵泡发育、退化和闭锁的调控机理。

此外,c-kit及其配体系统及Inhibin-α基因在卵泡的发育中也起到一定的作用,相关的功能还有待于进一步研究。

3 结束语

了解原始卵泡的生长启动机理,开发离体卵泡池中原始卵泡的启动,维持其生长达到卵细胞成熟排放时期,将有助于增大珍稀家禽、濒危动物和不育女性的生育潜力,有利于保护珍稀物种,给不育女性带来福音。

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(责任编辑:刘乃生)

Study on Mechan ism of In itiation and Growth of the Mammalian Primordial Follicle

GUO Shu-hua
(Weifang Un iversity,Weifang 261061,China)

The new ly research p rogress of the mammalian p rimo rdial follicle initiation w ere summarized, in order to p rovide the theoretical basis for further study on mechanism of female rep roductive.It also show es a p romising future about the endangered species and even the revival of extinct species.

mammalian,oocyte,follicle initiation

2010-09-12

郭淑华(1972-),女,山东昌邑人,潍坊学院生物工程学院副教授。

R335 文献标识码:A 文章编号1671-4288(2010)06-0106-04