Bmi-1及p16在宫颈癌变过程中的表达及意义

伍 艺

(重庆市妇幼保健院 400013)

宫颈癌是严重危害妇女健康与生命的常见病，居女性癌症死亡第2位，占女性生殖系统恶性肿瘤的首位。近年来，国内外研究表明，宫颈上皮肿瘤的发生、发展及预后与多种基因的变化密切相关。

近年来的研究表明，Bmi-1在胃癌、结肠癌[1-2]、肺癌、乳腺癌[3]等多种肿瘤中均有高表达[4]。p16基因又称多肿瘤抑制基因(multipie tumorsuppressor，M TS1)，是继 p53 基因之后的又一重要的抑癌基因[5]。近年来的研究表明在多种肿瘤中p16基因表达降低，如乳腺癌[6]、食管癌[7]、胃癌[8]，大肠癌。有研究表明在一些肿瘤中有Bmi-1基因表达增高并同时伴有p16基因的低表达。研究者发现Bmi-1基因与p16蛋白在小鼠淋巴瘤的发生过程中起协同作用。有学者发现Bmi-1 m RNA的表达水平在大肠癌组织中较癌旁组织显著升高，高表达的组织中p16蛋白明显低表达[9]。

但有关Bmi-1、p16与宫颈肿瘤关系的研究较少，本研究旨在检测Bmi-1基因和p16基因在正常宫颈、宫颈上皮肿瘤、宫颈癌中的表达水平，探讨二者在宫颈肿瘤中表达的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料 87份宫颈组织标本均来自本院2008～2009年子宫颈活检和手术切除的病理标本。年龄23～68岁，平均43.3岁。经病理证实正常宫颈上皮组织7例，CINⅠ级10例，CINⅡ级21例，CINⅢ级及原位癌组织17例，宫颈癌组织32例。均未做化学、免疫及放射治疗。

1.2 试剂与方法 鼠抗人Bmi-1单克隆抗体、鼠抗人p16单克隆抗体、羊抗鼠IgG均购自Santa Cruz公司。免疫组织化学SP试剂盒，购自北京中杉金桥生物技术有限公司。裂解液、BCA蛋白定量试剂盒、EC L发光试剂盒均购自碧云天生物技术研究所。免疫组化SP法按试剂盒要求进行操作。用已知阳性切片作阳性对照，PBS代替一抗作阴性对照。Western blot检测，于4℃下，取宫颈癌组织及癌旁组织各 0.5～1.0 g，加入裂解缓冲液，粉碎匀浆后，4℃静置 24 h，再于 4℃下 12000 r/min离心 20 min，提取总蛋白，并进行蛋白定量。经10%SDS-PAGE电泳、转印、5%脱脂奶粉封闭，Bmi-1(1∶1000)、p16(1∶1000)4℃下孵育过夜;二抗(1∶5000)室温下孵育2 h，EC L显色。

1.3 结果判断 免疫组化结果:Bmi-1阳性表达定位于细细胞核和细胞质，细胞核或细胞质出现棕黄色为染色阳性细胞。p16阳性同样定位于细胞核和细胞质，胞核或胞质出现棕黄色颗粒为阳性细胞。空白阴性对照的细胞不显色，阳性对照的细胞核和细胞质呈黄色、棕黄色或棕褐色。具体分类依染色细胞数及强弱而定，着色强度:无色(-)定为0分、浅黄色(+)定为1分、黄色及更深颜色(++)定为 2分;阳性细胞数:≤50%为定0分，＞50%～75%定为1分，＞75%定为2分。两项得分相乘结果大于或等于2定为阳性。Western blot检测结果经自动电泳凝胶成像分析仪进行，并进行灰度值测定。

1.4 统计学处理 应用SPSS13.0统计软件，进行χ2检验、t检验。检验水准α=0.05。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 Bmi-1及p16蛋白在各宫颈组织中的表达 p16及Bmi-1在正常子宫颈组织、CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ及原位癌、子宫颈癌组织中表达的阳性率见表1。由表1可见，Bmi-1蛋白的阳性率基本呈递增趋势;p16蛋白的阳性率呈递减趋势。

表1 Bmi-1、p16在宫颈各组病变中的蛋白表达

2.2 Bmi-1及p16蛋白与宫颈癌临床指标的关系 结果见表2。

表2 Bmi-1与p16在32例宫颈癌中的表达及其与临床的关系

2.3 Western blot检测Bmi-1、p16蛋白在宫颈癌及癌旁组织的表达 Bmi-1蛋白在宫颈癌癌旁组织中表达极少，而在宫颈癌组织中表达明显。相反p16蛋白在宫颈癌癌旁组织中表达明显，而在宫颈癌组织中表达减少。两种蛋白含量在宫颈癌与癌旁宫颈组织的差异均具有明显统计学意义(P＜0.01)，见表3。

表3 Bmi-1、p16在 18例宫颈癌及癌旁组织中的平均灰度分析()

表3 Bmi-1、p16在 18例宫颈癌及癌旁组织中的平均灰度分析()

检测指标 癌组织 癌旁组织 t P Bmi-1 106.50±6.03 98.52±5.73 3.839 0.001 p16 97.96±5.94 104.96±5.50 3.388 0.003

3 讨 论

近年来，子宫颈癌发病率呈年轻化倾向，35岁以下子宫颈癌的发病率出现上升趋势[10]，且以中晚期患者为多，预后较差。以往关于宫颈肿瘤的研究提示，其发病与多种因素有关，例如人乳头状瘤病毒感染、多产、初产年龄、性行为、经济状况、吸烟、长期使用避孕药等[11]。但近年来研究发现宫颈肿瘤是多基因、多因素协同作用所导致的。因此致宫颈肿瘤的基因作用是研究热点。

Bmi-1蛋白属 Ploycomb组蛋白(ploycomb-group，PcG)家族，是多梳基因家族中的一个癌基因。Bmi-1基因位于人染色体10p13，DNA 大小为4.9 kb，m RNA 为 3199 bp，含10个外显子，326个氨基酸编码序列。

p16基因是位于染色体9p21区的肿瘤抑制基因，是近年来发现的第一个直接参与细胞周期调控的抑癌基因，其编码的pl6蛋白依赖激酶K4或K6的抑制因子，直接调控细胞周期G～S期，是人类恶性肿瘤最为常见的分子事件。研究表明，p16在对宫颈良性癌变、CIN或癌的鉴别诊断中优于目前所用的其他免疫组化抗体[12]。

本研究中发现在正常宫颈组织中Bmi-1阳性表达率为0，而p16阳性表达率为100%。在宫颈上皮内瘤变组织中Bmi-1阳性表达率逐渐增高，p16阳性表达率逐渐降低。在宫颈癌中Bmi-1阳性表达率明显增高，pl6阳性表达率明显降低。另外这两种基因在CINⅢ级及原位癌组与宫颈癌组间差异有统计学意义，提示两种基因在早期判断宫颈肿瘤有一定的作用。为进一步探讨这两种基因表达与宫颈恶性潜能的关系，本研究分析了两种蛋白表达在不同临床病理指标间的差异，结果发现这两种基因的表达与肿瘤的临床分期及组织学分级相关，且组织学分级越低，Bmi-1蛋白的阳性表达率越高，而p16阳性表达率却越低。另外本研究发现，Bmi-1蛋白在宫颈癌组织中的表达明显高于癌旁组织，而p16在宫颈癌旁组织中的表达明显高于癌组织，这也说明Bmi-1具有抑制子(repressor)的功能，可以阻断细胞周期中的p16基因的位点，促进细胞转化和肿瘤形成。

肿瘤的发生、发展是一个多步骤的过程，往往是在致病因素作用同时，多种基因同时或先后协调作用的结果。本研究发现，Bmi-1、p16基因与人体宫颈肿瘤发生、发展密切相关，Bmi-1和p16均参与子宫颈癌前病变、癌变的发生和发展。临床上多种基因的同时监测，将有利于监控宫颈癌的发生、发展及预后的评估。

综上所述，检测Bmi-1、p16基因对判定宫颈癌生物学行为、预后和指导治疗具有重要意义。Bmi-1、p16基因有望成为基因治疗的新靶点。

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