EML4-ALK融合基因与非小细胞肺癌

陈佳艳 综述 樊旼 审校

复旦大学附属肿瘤医院放射治疗科，复旦大学上海医学院肿瘤学系，上海 200032

肺癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤，其中80%～85%的病例为非小细胞肺癌（nonsmall cell lung cancer，NSCLC）。据统计，在欧洲，每年肺癌新发病例超过20万，因其死亡的人数占所有癌症相关死亡的20%。在美国，每年约有15万患者死于肺癌［1-3］。在中国大陆，肺癌的发病率和病死率均呈显著升高的趋势。据2008年我国卫生部的统计，肺癌相关死亡率居恶性肿瘤总死亡率的首位，为30.83/10万。在男女恶性肿瘤相关死亡中，肺癌均为最主要原因［4］。

手术、放疗和化疗一直都是NSCLC的主要治疗方法。随着对肿瘤发病机制及其生物学行为研究的不断深入，人们越来越多的把焦点聚向了以特异性高、不良反应轻为特点的分子靶向治疗。近几年来，在肺癌的分子靶向治疗领域，研究热点一直集中在EGFR、K-ras和VEGF等靶点上，涌现出许多针对这些靶点的分子靶向药物。临床实践证明并非所有患者都能从中获益，NSCLC各组织类型间存在分子靶向药物疗效上的差异。例如多项临床试验结果均证实腺癌为EGFR-TKI的优势人群。然而即便同样身为腺癌患者，使用EGFR-TKI后有些可以获得疾病的长期缓解，有些会在TKI初始有效后出现获得性耐药，还有一些患者则原发性耐药。目前，已经发现在原有突变基础上，EGFR 20号外显子上C-T碱基置换后导致的T790M的错义突变，MET癌基因的扩增与EGFR-TKI获得性耐药有关［5］，K-ras基因突变则是产生原发耐药的相关机制之一［6］。近期发现的EML4-ALK融合基因，其与EGFR突变，K-ras突变的不共存现象以及含有该基因患者的鲜明临床特征，提示该靶点是肺腺癌特异性较高的分子标记物，并且很有可能是继T790M、K-ras之后EGFR-TKI耐药的又一重要机制，因此备受关注。

1 EML4-ALK基因的发现

2007年Soda等［7］在1例62岁的吸烟肺腺癌患者手术切除的标本中，扩增出一个由3 926 bp组成的DNA片段，可以编码一个由1 059个氨基酸组成的蛋白质，该蛋白的氨基端（残基1-496）是人类EML4编码蛋白（基因库编号NM-019063）的一部分，而羧基端（残基497-1059）则由人类ALK（基因库编号 AB209477）编码蛋白的一部分构成，研究人员从中得到启发，编码这一蛋白的基因很有可能是EML4和ALK融合基因。

EML4属于棘皮动物微管相关蛋白样蛋白家族，由N末端碱基区，疏水的棘皮动物微管相关蛋白区（hydrophobic echinoderm microtubule-associated protein-like protein，HELP）以及WD重复区3部分构成。在EML4-ALK融合基因中，与ALK的胞内近胞膜部分发生融合的是EML4的部分N末端碱基、HELP和部分WD重复区［8-10］。

ALK于1994年首先发现于间变性大细胞淋巴瘤AMS3细胞株中［11］，是由1 620个氨基酸组成的跨膜蛋白，属于胰岛素受体家族［12］。该蛋白由膜外部分、跨膜区域以及膜内催化区域组成，下游信号通路为Ras-ERK，JAK3-STAT3，以及PI3-K/Akt等，这些通路与细胞增殖、存活、迁移密切相关［13-14］。

2 EML4-ALK基因的体外转化致瘤活性

EML4-ALK融合基因的重排发生在2号染色体短臂上的2区1带和2区3带。Soda等［7］通过测序得出，EML4的13号外显子上断裂产生的3.6 kb大小的片段插入并连接上ALK的20号外显子的一个297 bp大小的片段，共同构成了融合基因（1型）。在这一研究的基础上，2008年研究人员把转染了融合基因的小鼠3T3成纤维细胞接种在裸鼠身上，建立了表达EML4-ALK融合基因的肺癌的转基因动物模型（小鼠），发现在小鼠肺部肿瘤发生的全过程中，EML4-ALK基因均发挥着重要作用，进一步在体外证实了该融合基因的转化致瘤活性。同时，他们发现EML4 N末端的碱基区域对于其致瘤活性最为关键，可能与其在EML4-ALK基因聚合过程中发挥重要作用有关［15］。

3 EML4-ALK基因与NSCLC

Soda等［7］在随后的研究中，应用RT-PCR的方法对于75例NSCLC患者的组织标本进行了EML4-ALK融合基因、EGFR18、19、20号外显子突变，以及K-ras突变的检测，发现5例患者存在EML4-ALK 1型融合基因（3例腺癌，2例鳞癌），同时发现该基因阳性的患者与EGFR以及K-ras突变阳性的患者没有重叠。并且，在继续检测了261例包括非霍奇金淋巴瘤、结直肠癌、胃肠道肿瘤在内的其他恶性肿瘤的EML4-ALK融合基因后，均未发现含有该基因。此外，研究中还发现了EML4在20号外显子附近断裂后与ALK进行融合的第2种亚型（2型）。最终，研究者得出结论，该融合基因很有可能是NSCLC特有的一个新型基因靶点。在检测方法上，RT-PCR是一种较为敏感的方法，可以在很少DNA拷贝数的情况下，甚至是在只有极少数EML4-ALK阳性细胞的痰液中，检测出融合基因的存在。

同年，Inamura等［16］使用RT-PCR的方法检测221例包含了腺癌、鳞癌、大细胞癌以及小细胞癌在内的肺癌患者EML4-ALK融合基因的mRNA情况，对于检测阳性的患者，进一步使用免疫组化的方法观察融合基因的表达。结果只在腺癌这一组织类型中检测到5例患者（3.4%）有融合基因的mRNA并均在细胞质中用免疫组化检测到ALK融合蛋白。

上述2项研究均来自日本，随后在1项来自欧美的多中心参与的研究中，Perner等［17］使用FISH方法检测600例NSCLC患者EML4-ALK基因情况，发现融合基因的发生率小于Soda报道的6.7%以及Kentaro 报道的3.4%，只有2.7%。并且在检测出融合基因的肿瘤中，并不是所有的肿瘤细胞均含有该融合基因。发生率的差异，可能与人种不同有关。研究人员因为仅仅在1例患者中证实融合基因为基因重排导致，由此认为就其机制而言，存在着比Soda等报道的简单插入更为复杂的，导致EML4-ALK融合基因产生的基因水平的改变。

由于早先研究淋巴瘤ALK融合基因类型的过程中，发现除了人们熟知的NPM-ALK之外还有10多种其他的融合方式，与淋巴瘤的发生发展密切相关。那么在NSCLC中，是否也存在除了EML4-ALK融合基因以外的其他类型的ALK融合基因，也有学者就此展开研究。Rikova等［18］的实验中，研究了41种NSCLC细胞株以及150例NSCLC肿瘤标本中磷酸化的酪氨酸相关的多个靶点，ALK相关融合基因除了3例为EML4-ALK外，还有1例为TFG-ALK融合基因。但在2008年Shinmura等［19］的研究中，使用RT-PCR以及测序检测的77例NSCLC患者，除了2例腺癌患者检测到EML4-ALK（2.6%，1型融合体和2型融合体各1例）外，并没有发现含有NPM、TPM3、CLTC、ATIC和TFG-ALK的其他ALK相关的融合基因。

随着研究的深入，研究人员还发现了EML4-ALK融合基因的其他亚型，区别主要在于EML4发生截断的位点不同。Choi等［20］报道了EML4的6号外显子附近与ALK 20号外显子衔接的亚型3。Takeuchi等［21］发现的EML4的14号外显子和2号外显子与ALK 20号外显子结合的亚型4和亚型5以及后来发现的亚型6和亚型7［22］。

就EML4-ALK是否为NSCLC唯一特有的靶点这一问题，Fukuyoshi等［23］分别检测了104例肺癌、555例胃肠道肿瘤、90例乳腺癌标本，仅1例肺癌标本中发现了EML4-ALK的转录，在其余的肿瘤中均未发现该融合基因，研究者认为这样的实验结果强烈提示这一靶点很有可能为NSCLC所特有。但是紧接着2009年Lin等［24］发表在 Mol Cancer Res上的研究中，209例乳癌患者5例检出该融合基因，83例结直肠癌患者2例检出，106例NSCLC中有12例检出，提示该融合基因也可能与包括肺癌在内的多种实体肿瘤相关，但仍以NSCLC中检出率最高。

4 EML4-ALK阳性患者的临床特征

有趣的是，随着实验数据的不断积累，和最初Soda等［7］得出的结果相一致，EML4-ALK融合基因确实极少与常见于NSCLC的EGFR突变以及K-ras突变并存于同一组织标本。一组来自日本的数据中，Inamura等［25］检测了363例肺癌组织样本，11例腺癌中检出融合基因，对于这11例标本，进一步研究其与EGFR、K-ras、TP53突变以及TTF-1的关系，他们发现EML4-ALK阳性的肿瘤具有下列特征：腺泡来源，分化更差，极少伴有EGFR以及K-ras的突变，偶尔伴有TP53突变，多发生于不吸烟或轻度吸烟患者，经常伴有TTF-1表达。香港大学的Wong等［26］对266例手术切除的原发性肺癌患者的标本进行了检测，13例患者（4.9%）标本中检出了融合基因，腺癌11例，腺鳞癌2例；同样地，他们发现融合基因更易发生于不吸烟、年轻以及EGFR，K-ras野生型的肺癌患者，差异有统计学意义。结合以上数据，2009年Shaw等［27］进行了更为细致的研究，他们以女性、亚裔、轻度或者不吸烟的腺癌中至少符合2项为标准，有选择性地挑选了141例NSCLC，检测了标本中的EML4-ALK、EGFR以及K-ras突变情况，共检出了19例（13%）EML4-ALK，其中18例为腺癌，1例为腺鳞癌。发生上述3种突变的患者没有重叠。与EGFR突变组以及EGFR、ALK突变均阴性的野生组相比，EML4-ALK阳性的患者更年轻，多为男性，轻度或者不吸烟。在有远处转移的患者中，该融合基因与EGFR TKI的抗拒性有关。

那么中国人群NSCLC患者中该融合基因的情况究竟如何。2009年Zhang等［28］使用RACEPCR为基础的测序法共检测了109例NSCLC标本，检出12例阳性（11.01%），除外1、2、3、5亚型外，在3例腺癌患者中检出了EML4 18号外显子的亚型。所有EML4-ALK阳性患者均无K-ras突变，但是与以往研究不同的是，在1例女性腺癌中出现EML4-ALK与EGFR19号外显子突变的并存。是否在中国NSCLC患者中有不一样的情况，还需要进一步研究。关于EML4-ALK基因在NSCLC中检出情况见表1。

表1 EML4-ALK在NSCLC中检出情况Tab.1 Studies evaluating EML4-ALK positivity in NSCLC

5 针对EML4/ALK基因的抑制剂

任何一个肿瘤新靶点的发现，最后都着眼于设计出安全有效的药物，在分子水平治疗上肿瘤。1项欧美与韩国共同参与的多中心研究初步评价了针对EML4-ALK这一新型靶点的抑制剂。Koivunen等［29］使用RT-PCR以及外显子序列分析的方法分析了305例NSCLC患者（美国138例，韩国167例）组织以及83个NSCLC细胞株，8例（3%）患者肿瘤中以及3个细胞株中（3.6%）检出融合基因。在1例NSCLC细胞株体外、体内实验中，针对ALK的抑制剂TAE684体现了抑制ALK激酶活性、增加肿瘤细胞凋亡的作用。另外一种口服的AKT抑制剂（PF02341066）目前正在Ⅰ期临床试验中接受安全性和有效性的评估［30］。

综上所述，EML4-ALK是NSCLC发生发展中独立而又关键的分子靶点，主要发生于腺癌，EGFR、K-ras野生型，轻度吸烟/不吸烟，年轻男性患者。可能是T790M、K-ras和MET之外另一潜在的EGFR-TKI耐药机制之一。针对这一靶点的深入研究，将有助于筛选EGFRTKI合适的治疗人群并开创EGFR-TKI耐药的NSCLC靶向治疗新领域。

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