大鼠重症急性胰腺炎MODS免疫改变及药物影响

尤胜义，寇 丽，王春立，薛 强

大鼠重症急性胰腺炎MODS免疫改变及药物影响

尤胜义，寇 丽，王春立，薛 强

目的：观察不同药物对重症急性胰腺炎（SAP）免疫功能的影响。方法：建立大鼠SAP-MODS模型，分别予地塞米松、乌司他丁、善宁、二硫代氨基甲酸吡咯烷（PDTC）及中药莱菔承气汤治疗。观察各组一般情况及死亡率，术后24 h血清淀粉酶、TNF-α、IL-6、IL-10及血浆内毒素水平，流式细胞仪对脾脏T淋巴细胞亚群比例及凋亡情况进行三色荧光分析，并取胰腺、肺、肾、肝脏组织行病理学检查。结果：地塞米松可明显降低促炎细胞因子TNF-α和IL-6水平，但同时也使SAP大鼠CD4+T细胞的异常凋亡进一步增加，加剧免疫功能障碍。善宁及PDTC可降低TNF-α和IL-6水平，对T细胞功能无明显影响。乌司他丁和莱菔承气汤则可同时降低促炎细胞因子TNF-α、IL-6及抗炎细胞因子IL-10水平，减少CD4+T细胞异常凋亡、改善细胞免疫功能，明显降低死亡率、减轻脏器损伤；只有莱菔承气汤可显著降低血浆内毒素水平。结论：乌司他丁和莱菔承气汤有助于调节促炎／抗炎反应机制平衡、改善机体免疫功能，地塞米松可加剧SAP免疫损伤。

重症急性胰腺炎；免疫功能；T淋巴细胞亚群；细胞因子；药物

重症急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP）是伴有免疫紊乱的全身性疾病，免疫平衡的重要性在SAP的治疗中已逐渐受到关注。本研究在建立大鼠SAP模型的基础上，对比观察胰腺炎常用治疗药物，包括糖皮质激素地塞米松、生长抑素、善宁、蛋白酶抑制剂乌司他丁以及NF-кB活性阻断剂PDTC和中药莱菔承气汤的疗效及对免疫功能的影响。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 原位细胞凋亡检测试剂盒（罗氏公司）；R-PE荧光标记CD4单抗及PerCP荧光标记CD8单抗（BD公司）；大鼠淋巴细胞分离液（天津灏洋生物制品有限公司）；大鼠IL-10 ELISA试剂盒（Biosource公司）；大鼠TNF-α、IL-6放免试剂盒（北京科美东雅生物技术有限公司）；二硫代氨基甲酸吡咯烷（PDTC，Sigma公司）；莱菔承气汤由天津医科大学总医院中药房提供。方剂组成：川军（后下）20 g，芒硝15 g，川朴15 g，枳壳10 g，莱菔子15 g，木香10 g，牛膝10 g，加水煎制成200 mL药液。

1.2 模型制作及分组 健康Wistar大鼠84只，体重220～250 g，随机分为对照组、SAP模型组、地塞米松组、善宁组、乌司他丁组、PDTC组和中药组，每组12只。采用胆胰管逆行注入5%牛磺胆酸钠（1 mL/ kg）的方法[1]建立大鼠SAP模型。各组术后分别腹腔注射相应药物：地塞米松组1 mg/kg体重，善宁组50 μg/kg体重，乌司他丁组1万U/kg体重，PDTC组10 mg/kg体重，其他组注射生理盐水0.5 mL，8 h后重复1次。此外，中药组莱菔承气汤2 mL/100 g体重，分两次灌胃；其他组等量生理盐水灌胃。

1.3 检测指标 观察各组大鼠一般情况及死亡率。血清淀粉酶及血浆内毒素测定：各组大鼠于术后24 h乙醚吸入麻醉后，无菌条件下心脏穿刺取血，即刻送检测定血清淀粉酶及血浆ET水平。

血清细胞因子检测：其余血标本离心分离血清，-20℃保存，ELISA法集中检测血清IL-10水平，放免法测定TNF-α和IL-6水平。

脾淋巴细胞亚群及凋亡检测：各组大鼠于无菌条件下取脾，获得单个核细胞，于37℃5%CO2培养箱中培养2 h，使巨噬细胞贴壁，分离纯化所得细胞悬液即为脾淋巴细胞悬液。调整细胞浓度至2× 107个/mL，取100 μL细胞悬液，加入20 μL R-PE标记CD4单抗和20 μL PerCP标记CD8单抗，常温避光孵育60 min。采用异硫氰酸荧光素（FITC）标记的TUNEL法标记凋亡细胞，以FACS Calibur流式细胞仪（BD公司）对已完成表面标记及凋亡标记的样本进行三色荧光分析。

1.4 病理学检查 取大鼠胰腺、肝脏、肺和肾脏置于10%福尔马林中固定，石蜡切片，HE染色。由专业病理医师阅片，并行胰腺组织半定量病理评分，评分标准参见文献[2]。

1.5 统计学处理 死亡率统计采用χ2检验；所有检测数据均以表示，计量资料均数间比较采用单因素方差分析，方差齐性采用LSD法、方差不齐采用Tamhane’s T2法进行多重检验。

2 结果

2.1 大鼠一般情况及死亡率 SAP模型组大鼠一般状况差，出现精神萎靡、反应迟钝、懒动、竖毛、呼吸急促、拒食等表现，24 h死亡率达50%。各治疗组大鼠一般状况有不同程度改善，以乌司他丁组、PDTC组和中药组较为明显，死亡率为16.7%显著下降，地塞米松组41.7%，善宁组为33.3%，中药组大鼠术后24 h内出现排便反应。

2.2 血清淀粉酶及血浆内毒素水平 见表1。

2.3 血清细胞因子水平 SAP模型组大鼠血清TNF-α、IL-6和IL-10水平均明显高于对照组，各治疗组均可显著降低血清TNF-α和IL-6水平，而只有乌司他丁组和中药组可同时降低血清IL-10水平，地塞米松组IL-10水平有升高趋势。见表2。

表1 各组大鼠血清淀粉酶和血浆内毒素水平

表1 各组大鼠血清淀粉酶和血浆内毒素水平

注：与对照组相比，△△P＜0.01;与SAP模型组相比,**P＜0.01

组别对照组SAP模型组地塞米松组乌司他丁组善宁组PDTC组中药组n 12 6 7 1 0 8 1 0 10淀粉酶(U/L) 1 983.08±315.41 8 447.83±1 121.04△△7 086.14±1 260.10 4 114.91±893.03**3 459.00±740.84**3 573.94±623.23**3 871.82±779.25**LPS(pg/mL) 24.61±6.26 137.60±27.84△△167.79±38.27 119.07±28.54 121.50±20.41 128.51±28.42 65.76±18.05**

表2 各组大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-10水平

表2 各组大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-10水平

注：与对照组相比,△△P＜ 0.01；与SAP模型组相比,*P＜ 0.05,**P＜0.01

组别对照组SAP模型组地塞米松组乌司他丁组善宁组PDTC组中药组TNF-α(ng/mL) 0.816 7±0.248 6 2.013 3±0.371 3△△1.704 3±0.173 6*1.431 8±0.293 5**1.590 0±0.261 0**1.240 8±0.341 2**1.330 0±0.270 7**IL-6(pg/mL) 183.44±25.75 397.74±69.23△△308.39±51.95**291.00±39.86**305.86±50.35**245.32±46.82**268.34±35.78**IL-10(pg/mL) 33.16± 8.36 64.86±16.38△△72.83±13.43 42.61± 9.19**57.53±11.65 52.62±10.95 48.96±12.79*

2.4 T淋巴细胞亚群比例及凋亡分析 SAP模型组大鼠CD4+T细胞百分比及CD4+/CD8+比值均明显低于对照组，同时CD4+T细胞凋亡率明显升高；地塞米松组CD4+T细胞凋亡率进一步升高，CD4+T细胞百分比及CD4+/CD8+比值出现进一步下降；乌司他丁组和中药组CD4+T细胞凋亡率较SAP组有明显下降，CD4+T细胞百分比及CD4+/CD8+比值明显改善；其余两组与SAP组之间无显著性差异，见表3。

表3 各组大鼠T淋巴细胞亚群比例及凋亡检测结果

表3 各组大鼠T淋巴细胞亚群比例及凋亡检测结果

注：与对照组相比,△△P＜0.01;与SAP模型组相比,*P＜0.05

组别对照组SAP模型组地塞米松组乌司他丁组善宁组PDTC组中药组CD4+(%) 39.42±2.86 27.79±2.80△△22.35±2.72*32.22±2.89*29.86±3.07 30.18±3.05 31.43±2.92*CD8+(%) 20.49±2.63 31.73±3.30 34.12±3.93 26.73±2.53 31.40±2.78 33.26±3.18 29.29±1.46 CD4+/CD8+1.94±0.13 0.88±0.11△△0.67±0.08*1.22±0.06*0.96±0.10 0.90±0.08 1.08±0.11*CD4+凋亡率(%) 4.00±0.48 21.58±2.72△△43.47±5.17*13.38±1.14*20.15±2.38 18.56±1.86 15.47±1.35*

2.5 病理学检查 SAP模型组大鼠胰腺出现大片出血、凝固性坏死和脂肪坏死，坏死区大量中性粒细胞为主的炎细胞浸润；肺泡壁明显增厚，部分肺泡腔萎陷，肺间质充血水肿，炎细胞浸润，肺泡腔内可见浆液性渗出；肝细胞呈片状坏死，汇管区大量炎细胞浸润；肾小管上皮细胞出现空泡、浊肿、水样变性，病理结果符合急性出血坏死性胰腺炎致MODS表现。各治疗组大鼠各脏器病理表现较之有不同程度的改善。见表4。

表4 各组大鼠胰腺病理评分比较

表4 各组大鼠胰腺病理评分比较

注：与SAP模型组相比,*P＜0.05,**P＜0.01

组别SAP模型组地塞米松组乌司他丁组善宁组PDTC组中药组水肿3.67±0.52 2.54±0.69*2.18±0.98**2.38±0.92**2.24±0.87**2.09±0.94**炎症3.00±0.63 1.71±0.76**1.45±0.93**2.00±0.76*1.33±0.64**1.55±0.69**出血1.67±0.82 1.57±0.79 0.82±0.60*0.88±0.64*0.96±0.52*1.00±0.63坏死3.00±0.89 2.29±0.76 1.00±0.78**1.50±0.76**1.02±0.65**1.18±0.60**总分11.33±2.16 9.86±1.86 5.36±1.96**6.50±1.60**5.45±1.52**5.82±1.33**

3 讨论

本研究中观察的几种急性胰腺炎临床常用治疗药物，不同程度地在降低血清淀粉酶、减轻胰腺及胰外脏器病理损害等方面显示出一定的治疗作用，但对机体免疫功能的影响却不尽相同。

传统的糖皮质激素治疗确实可在一定程度上缓解SAP的病情，但另一方面也加剧了病程中的免疫抑制。实验发现，地塞米松可通过诱导CD4+T细胞凋亡进一步增加，加剧SAP大鼠T细胞亚群比例失调及细胞免疫功能障碍。此外，地塞米松能够明显降低血清TNF-α和IL-6水平，IL-10水平反而有升高趋势，其对促炎细胞因子和抗炎细胞因子的选择性作用，使免疫平衡更加向抗炎反应方向倾斜，而过度的抗炎反应势必加重SAP免疫抑制。实验结果提示，糖皮质激素在减轻炎症反应的同时，可能加剧免疫功能抑制，以至发生继发感染、脓毒血症甚至MODS的危险，如何权衡在SAP的临床治疗中的利弊有待进一步研究。

善宁是人工合成的一种生长抑素类似物，实验显示，善宁在抑制胰腺分泌、降低血清淀粉酶方面的作用优于其它治疗组，同时也具有一定的抑制促炎细胞因子分泌的作用，但对T细胞免疫功能无明显影响，在减轻脏器病理损害和减少病死率方面也没有显示出明显优势。

乌司他丁是一种广谱的酶抑制剂，目前已成为急性胰腺炎临床治疗的重要选择，实验中也显示出良好的治疗效果。此外，乌司他丁对免疫功能亦具有一定的调节作用，一方面可通过减少CD4+T细胞的异常凋亡改善T淋巴细胞亚群比例失调及细胞免疫功能障碍，另一方面可以同时抑制促炎细胞因子和抗炎细胞因子的产生，使SAP时机体的免疫紊乱趋于缓和。

NF-кB是一种具有转录调节作用的核蛋白，可启动诸多细胞因子和炎症介质基因的转录和翻译，在SAP发生发展过程中起着重要作用。PDTC是一种NF-кB活性阻断剂，可通过不同方式拮抗NF-кB的活性。实验证实，PDTC可明显降低血清促炎细胞因子TNF-α和IL-6水平，缓解过度的炎症反应，减轻胰腺组织病理损害，但对IL-10水平无明显影响，提示IL-10的分泌可能存在NF-кB以外的其他调控途径。

莱菔承气汤是我院中西医结合治疗SAP常用药物，取得较好的临床疗效。研究证实莱菔承气汤可减少SAP死亡率和多脏器病理损害。其对SAP免疫紊乱多环节、多靶点的综合调控作用表现为有效降低血浆内毒素水平，减少CD4+T细胞的异常凋亡，改善细胞免疫功能，抑制促炎及抗炎细胞因子的产生，使机体过度的抗炎和促炎反应恢复为一种低水平的平衡态，减轻机体免疫损伤，有助于缓解可能发生的SIRS和CARS，减少MODS和严重感染的发生率。莱菔承气汤在SAP综合治疗中对机体免疫平衡调节的影响，有待进一步研究。

[1]寇丽,王春立,尤胜义.重症急性胰腺炎大鼠脾脏巨噬细胞Toll样受体4的表达及分泌细胞因子水平的变化[J].中华实验外科杂志,2007,24（4）:404.

[2]许永春,李兆申,屠振兴,等.单核细胞趋化蛋白在重症急性胰腺炎发病机制中的作用[J].胰腺病学,2004,4（2）:94.

（收稿：2009-10-08）

（责任编辑 瞿 全 崔乃强）

Effect of Different Drugs on Immune Function of Rats in Severe Acute Pancreatitis

You Shengyi,Kou Li, Wang Chunli,et al. Tianjin General Hospital,Tianjin(300052),China

Objective To observe the different effects of drugs on immune function in SAP.Methods SAP-MODS model in rats was established,then treated with dexamethasone(DXM),ulinastatin,octreotide, PDTC or LaiFuChengQiTAng(LFCQ)respectively.The blood levels of amylase,endotoxin and cytokines including TNF-α,IL-6 and IL-10 were measured after 24 h.T lymphocyte subsets of the spleen with their apoptotic rate were measured by Flow Cytometry.Pathologic changes of the pancreas,liver,lung and kidney were also detected.Results DXM decreased the levels of TNF-α and IL-6.At the same time,the abnormal apoptosis rate of CD4+T lymphocytes increased all the more,leading to deeper immune disorder.Octreotide and PDTC could decrease TNF-αand IL-6 but no effects on T lymphocyte function.Ulinastatin and LFCQ decreased the levels of inflammatory cytokines(TNF-αand IL-6)and anti-inflammatory cytokine(IL-10)simultaneously; and the abnormal apoptosis rate of CD4+T lymphocytes decreased obviously,the mortality rate and pathologic injury reduced either.LFCQ showed the only effect on eliminating endotoxin.Conclusion DXM aggravates immune disorder in SAP,Ulinastatin and LFCQ are helpful in regulating the balance of inflammation and anti-inflammatory response and also improving immune function.

severe acute pancreatitis,immune function,T lymphocyte subsets,cytokine，medication

Q95-33;R657.5+1

A

1007-6948(2010)02-0192-03

国家科技支撑计划项目（2006BAI04A15）

天津市自然科学基金资助项目（043609511）

天津医科大学总医院中西医结合外科（天津300052）