慢性胰腺炎糖代谢特征及柴胡疏肝散的干预作用

薛承锐,周晓磊

实验研究

慢性胰腺炎糖代谢特征及柴胡疏肝散的干预作用

薛承锐,周晓磊

目的：观察慢性胰腺炎大鼠糖代谢变化以及中药柴胡疏肝散对其的干预作用。方法：Wistar大鼠制备慢性胰腺炎模型，随机分为模型组、对照组、中药低剂量组和高剂量组，进行糖耐量和胰岛素耐量实验，RT-PCR法和Western blot法检测肝脏胰岛素受体mRNA水平和蛋白表达变化。结果：模型组大鼠存在糖耐量异常和胰岛素抵抗，肝脏胰岛素受体表达较对照组显著降低（P＜0.05），两中药组的表达较模型组显著上调（P＜0.05）。结论：慢性胰腺炎引起糖代谢障碍，柴胡疏肝散可能是通过上调肝脏胰岛素受体表达的机制，改善胰岛素抵抗，进而发挥治疗糖代谢障碍的作用。

慢性胰腺炎；糖代谢；胰岛素受体；柴胡疏肝散

慢性胰腺炎(chronic pancreatitis,CP)是由于各种原因造成的胰腺实质局部、节段性或弥漫性慢性进展性炎症[1]，可导致胰腺内、外分泌功能障碍。内分泌功能障碍临床上表现为不同程度的糖代谢障碍，包括糖耐量异常和高血糖等。文献报道，约1/3的CP患者继发糖尿病，70%以上的患者存在糖耐量异常[2]。因此，深入研究CP糖代谢特征及其发生机制，探索新型治疗药物对于改善患者的预后，具有重要的科学意义。

1 材料与方法

1.1 实验动物 清洁级雌性Wistar大鼠40只，体重180～250 g，购自中国医学科学院放射医学研究所实验动物中心(许可证编号SCXK津2005-0001)， 12 h日光灯照射维持昼夜循环。

1.2 主要试剂 99%油酸购自美国Sigma公司；柴胡疏肝散（柴胡6 g、陈皮6 g、川芎4.5 g、香附4.5 g、枳壳4.5 g、芍药4.5 g、炙甘草1.5 g）由天津医科大学总医院制剂室煎制成浓度0.56 g/mL的水煎剂；胰岛素受体(insulin receptor,IR)和β-actin兔抗大鼠单克隆抗体均购自美国Santa Cruz公司，辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG购自美国Sigma公司，PCR扩增引物由南京金斯特公司合成。

1.3 分组与干预 大鼠随机分为模型组、对照组、中药低剂量组和高剂量组，每组10只。模型组和两中药组大鼠采用油酸胰胆管注射的方法建模；对照组仅打开腹腔轻度翻转胰腺后关腹。6周后中药低剂量和高剂量组大鼠，分别每日每只予柴胡疏肝散水煎剂1.4 g/kg、2.8 g/kg体重灌胃，模型组与对照组大鼠予等量蒸馏水灌胃，共4周。整个实验持续10周。

1.4 口服葡萄糖耐量实验 口服葡萄糖耐量实验（oral glucose tolerance test,OGTT）：给药后4周，大鼠禁食16 h，按2 g/kg剂量将预先配制好的1.11 mmol/L无菌葡萄糖溶液灌胃，尾静脉取血，微量血糖仪测定各组大鼠0、30、60、120、180 min血糖值。

1.5 胰岛素耐量实验 胰岛素耐量实验(insulin tolerance test,ITT)：给药后4周，各组大鼠按0.75 UI/kg的人胰岛素注射，于注射后0、30、60、120 min尾静脉取血微量血糖仪测定血糖。

1.6 RT-PCR检测肝脏IR mRNA水平 OGTT和ITT实验后，10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，开腹迅速摘取肝脏组织，即刻液氮冷冻2 h，-76℃低温冰箱保存备用。TRIzol提取肝脏总RNA，取2 μg总RNA反转录，25 μL反应体系进行PCR反应。引物序列如下：IR上游引物5’-AGG ACT GGC GCT GTG TAA A-3’及下游引物5’-CTG AGT GAT CGT GAG GTT GTG-3’，扩增片断524 bp；β-actin上游引物5’-GTTGACATCCGTAAAGACC-3’及下游引物5’-TCATCGTACTCCTGCTTG-3’，扩增片断233 bp。反应条件为：94℃变性5 min后，进入94℃变性30 s，63℃退火30 s，72℃延伸45 s的热循环，循环35次后，终末延伸5 min。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳，以目的片段与内参扩增片段条带的吸光度积分值的比值来评定IR mRNA的表达水平。

1.7 Western blot检测肝脏IR蛋白表达 取100 mg冻存组织，加入裂解液冰浴中匀浆，低温离心去除DNA和细胞碎片，BAC法测定蛋白总量。按每样品槽20 μg蛋白上样，经聚丙烯酰胺凝胶电泳后转移到硝酸纤维素膜上，封闭抗原后加入一抗（1∶200）4℃过夜，次日洗膜后进行二抗杂交（1∶2 000），DAB法显色。以目的蛋白与内参蛋白条带的吸光度积分值的比值来评定IR蛋白的表达水平。

1.8 统计处理 采用SPSS 17.0统计软件进行数据处理，计量资料均以表示，多个样本均数间比较用单因素方差分析(one way ANOVA)，均数间两两比较用LSD检验。以P＜0.05为显著性差异标准。

2 结果

2.1 OGTT实验 药物干预4周后，OGTT结果显示，空腹状态下(0 min)血糖：模型组血糖较对照组显著升高（P＜0.05），高剂量组与模型组比较显著降低（P＜0.05），而低剂量组与模型组比较无显著性差异（P＞0.05）。30 min和60 min血糖：模型组较对照组显著升高（P＜0.05），两中药组与模型组比较均显著降低（P＜0.05），两组之间比较无显著性差异（P＞0.05）；120 min血糖：模型组仍显著高于对照组（P＜0.05），低剂量组较模型组血糖有一定程度降低（P＞0.05），高剂量组与模型组比较显著降低（P＜0.05）；180 min血糖：模型组仍显著高于对照组（P＜0.05），两中药组均显著低于模型组（P＜0.05）。各时点血糖值见表1。

表1 各组大鼠不同时间点血糖OGTT结果(mmol/Ln=10)

表1 各组大鼠不同时间点血糖OGTT结果(mmol/Ln=10)

注：与对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05；高剂量组与低剂量组比较，△P＜0.05

组别对照组模型组低剂量组高剂量组180 min 4.10±0.68#6.78±0.37*5.23±1.31*#4.43±0.77#0 min 4.02±0.43#5.75±0.19*5.65±1.03*4.78±0.64#30 min 6.73±1.54#8.98±1.74*7.52±0.68#7.33±0.71#60 min 6.37±1.01#9.17±1.72*7.37±0.41#7.08±0.37#120 min 5.27±0.38#7.32±1.09*6.63±0.90*5.40±1.24#△

2.2 ITT实验 注射胰岛素后0 min血糖：各组之间比较均无显著性差异；30 min和60 min血糖：对照组较模型组显著降低（P＜0.05），两中药组的血糖也显著低于模型组（P＜0.05），而两组之间比较无显著性差异（P＞0.05）；120 min血糖：对照组仍低于模型组（P＜0.05），高剂量组也显著低于模型组（P＜0.05），而低剂量与模型组比较无显著性差异（P＞0.05）。各时点血糖值见表2。

表2 各组大鼠不同时间点血糖ITT结果(mmol/L，,n=10)

表2 各组大鼠不同时间点血糖ITT结果(mmol/L，,n=10)

注：与对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05

组别对照组模型组低剂量组高剂量组120 min 4.05±1.54#5.52±1.46*5.13±1.19 4.02±1.09#0 min 4.78±1.36 5.32±1.79 5.93±0.26 5.35±0.26 30 min 3.23±0.43#4.53±1.57*3.43±0.63#3.20±0.45#60 min 2.73±0.68#4.20±1.55*2.63±0.44#2.53±0.75#

2.3 肝脏IR mRNA水平 模型组IR mRNA水平显著低于对照组(P＜0.05)，两中药组与模型组比较均显著上调(P＜0.05)，而且高剂量组mRNA水平显著高于低剂量组(P＜0.05)。

2.4 肝脏IR蛋白表达 模型组IR蛋白表达显著低于对照组(P＜0.05)，两中药组与模型组比较均显著增高(P＜0.05)，而且高剂量组蛋白表达更接近于对照组，二者比较无显著性差异（P＞0.05）。

3 讨论

随着我国人民生活水平提高和饮食结构改变，CP的发病率逐年增加，对CP引起糖代谢障碍的研究越来越重要，如何平稳安全地控制这类患者的血糖仍然是一项世界性难题。传统中医理论认为，CP的病因多为长期嗜酒、饮食不节、情志不畅，致使肝胆脾胃功能失调，而表现为肝郁气滞，脾胃湿热蕴结为主的实热或湿热郁结。胰腺炎症反复发作，久之肝胃郁热，火炎于上，津液泄于下；肝之疏泄太过，肾之闭藏失司，则糖尿病“三多一少”症状随之而起。本实验中，OGTT结果显示模型组各时点血糖值较对照组均显著升高，表明CP模型大鼠的糖耐量异常，即糖代谢发生障碍；同时ITT结果显示注射胰岛素前，模型组与对照组比较血糖值并没有显著性差异，而注射后30 min、60 min和120 min 3个时点的血糖值均显著高于对照组，提示CP模型大鼠存在胰岛素抵抗，可能是导致糖代谢障碍的一个重要因素。

柴胡疏肝散源于明·张介宾《景岳全书》，是在《伤寒论》四逆汤的基础上去枳实加枳壳、陈皮、川芎、香附而成，具有疏肝解郁、理气止痛功效，临床常用于治疗肝气郁结证。本实验应用柴胡疏肝散水煎剂治疗4周后，OGTT实验显示两中药组大鼠的糖耐量较模型组有不同程度的改善，高剂量组各时点的血糖值均显著低于模型组，而低剂量组30 min、60 min和180 min的血糖值也显著低于模型组；ITT结果亦显示两中药组的胰岛素抵抗较模型组有不同程度的改善，高剂量组30 min、60 min和120 min的血糖值显著低于模型组，而低剂量组30 min和60 min的血糖值显著低于模型组，这些结果表明柴胡疏肝散治疗CP糖代谢障碍疗效确切，能够明显改善糖耐量异常和胰岛素抵抗，而且效果呈一定剂量依赖性。

近年来的研究表明，机体在CP病理状态下，存在明显的肝脏胰岛素抵抗，即胰岛素抑制肝脏葡萄糖输出(hepatic glucose production,HGP)的能力下降，引起血糖升高[3-4]。参与胰岛素信号转导的有IR、IR后的信号转导通路及作用的效应蛋白，任何一部分出现异常均可导致胰岛素抵抗[5-8]。IR为一种跨膜蛋白，有2个α亚基和2个β亚基构成，广泛存在于肝脏等对胰岛素作用敏感的组织细胞膜上。胰岛素与IR的α亚基结合后，启动β亚基酪氨酸蛋白激酶活性，引起β亚基自身酪氨酸磷酸化，进而导致胰岛素受体底物磷酸化，发挥胰岛素的生物学效应。IR数目和亲和力的改变都可以引起胰岛素信号转导异常。因此本实验对CP模型大鼠的肝脏IR表达进行了研究，RT-PCR结果显示模型组肝脏IR的mRNA水平较对照组显著降低，而Western blot也得到了一致的结果，这些表明IR表达的降低可能是CP引起肝脏胰岛素抵抗，进而导致糖代谢障碍的机制之一。另外，两中药组的肝脏IR mRNA水平和蛋白表达较模型组有不同程度的上调，表明柴胡疏肝散可能是通过上调肝脏IR表达的机制，治疗CP糖代谢障碍的。

CP大鼠的糖代谢发生障碍，表现为糖耐量异常和胰岛素抵抗，应用柴胡疏肝散治疗4周后，CP大鼠的上述异常均得到了改善，上调肝脏IR表达可能是其治疗机制之一，本研究为探索新型的针对CP患者的降糖药物提供了新思路，对于改善CP患者的预后具有潜在应用价值。

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（收稿：2009-10-08）

（责任编辑 瞿 全 崔乃强）

Glycometabolism in Chronic Pancreatitis and Intervening Effect of Chaihu Shugan San（柴胡疏肝散）

Xue Chengrui,Zhou Xiaolei. Department of Surgery Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, General Hospital of Tianijin Medical University,Tianjin(300052),China

Objective To observe the glycometabolism in chronic pancreatitis rats,and the intervention of chaihu shugan san(柴胡疏肝散)on the changes. Methods Chronic pancreatitis rat model was established by injection of oleic acid into the pancreatic duct,and 40 rats were divided into model group,chaihushugansan high dose group,and low dose group randomly,moreover with a control group.Glucose tolerance test and insulin tolerance test were carried out.The level of hepatic IR mRNA was determined by reverse transcription poly⁃merase chain reaction.Expression of hepatic IR was observed by Western blot. Results Compared with the control group,glucose and insulin tolerance of model group was abnormal,the hepatic IR in mRNA level and expression was decreased significantly.While compared with the model group,the expression of IR medication groups was up-regulated significantly. Conclusion Chronic pancreatitis caused glycometabolism dysfunction. Chaihushugansan can up-regulate the expression of IR,attenuating the insulin resistance,resulting in the im⁃provement of glycometabolism in chronic pancreatitis.

chronic pancreatitis,glycometabolism,insulin receptor,chaihushugansan

R675.5+1

A

1007-6948(2010)02-0189-03

天津医科大学总医院中西医结合外科（天津300052）