全反式维甲酸对兔颈动脉粥样硬化斑块中细胞凋亡及p53的影响

王国栋,张冬,郭英华,董果雄

动脉粥样硬化所致心脑血管疾病是当前主要死因之一。血管细胞凋亡可减少细胞成分在血管内膜积蓄、清除炎症细胞及减少泡沫细胞形成。全反式维甲酸(all-transretinoicacid,ATRA)作为一种维生素A类衍生物,可抑制血管平滑肌细胞(VSMC)增殖[1],从而减轻动脉狭窄。本实验研究AT RA对兔颈动脉动粥样硬化斑块是否有抑制作用及其是否促细胞主动凋亡。

1 材料和方法

1.1 材料 试剂与仪器:AT RA:上海第六制药厂,生产批号:030401;胆固醇:上海生物制剂公司;TUNEL凋亡试剂盒、p53一抗及通用型二抗三抗:中山生物技术有限公司;VIDAS计算机图像分析系统:德国欧波同公司。

分组:新西兰大白兔40只,体重(2.50±0.25)kg,雌雄不限(购于山东药检所,许可证号:鲁动质字2002012),随机分为4组:正常组(n=4)、假手术组(n=12)、手术组(n=12)、治疗组(n=12)。

1.2 方法

1.2.1 动物模型的建立及用药 除正常组外,各组动物均给予6%猪油、1.5%胆固醇及92.5%基础饲料喂养。2周后按Fishman方法[2]施行颈动脉内膜空气干燥术:兔静脉麻醉后,分离右颈总动脉(长约2.5 cm),两端动脉夹临时阻断血流。用流量为250 ml/min的气流灌注,历时8 min造成内皮干燥,然后恢复血流,止血、缝合。术后肌注青霉素4×105U/d。假手术组只切开,不进行空气干燥;术前1 d,治疗组给予ATRA 20 mg灌胃,手术组给予等量植物油灌胃。术后第2、4周处死动物,取目的血管待检。

1.2.2 取材、病理染色 取右侧颈总动脉进行HE染色。显微镜下进行形态学观察,并行计算机图像分析,计算内膜、中膜面积及内膜与中膜面积比例(I/M)。

1.2.3 凋亡细胞及p53检测 TUNEL法细胞凋亡测定按照凋亡试剂盒说明操作,TUNEL阳性细胞为棕黄色核染,TUNEL阳性细胞数占全部细胞数的比例为细胞凋亡率。p53一抗稀释浓度为1∶200,其余操作按照免疫组化步骤进行。p53阳性细胞核显示棕黄色颗粒。

1.3 统计学方法 使用SPSS 11.5软件进行统计学分析。实验数据用(±s)表示,采用t检验。

2 结果

手术过程中,实验兔因空气栓塞死亡1只。高脂饮食兔血清中胆固醇和甘油三酯的平均水平为(48.45±10.36)mmol/L和(11.94±3.71)mmol/L,显著高于正常组(12.27±2.14)mmol/L和(0.76±0.19)mmol/L(P＜0.001)。

2.1 HE染色 正常组和假手术组兔颈动脉内膜无明显细胞增殖,只有单层内皮细胞覆盖。术后2周,手术组和治疗组均有平滑肌细胞增生,内膜增厚。4周时手术组内膜增生更加明显,可见内皮下泡沫细胞,出现粥样硬化斑块、管腔狭窄;而治疗组内膜增生不明显,管腔无明显狭窄;治疗组和手术组内膜(I)、中膜(M)面积及I/M比见表1。

2.2 细胞凋亡 正常组和假手术组血管TUNEL染

色仅偶见阳性细胞着色。术后第2周,手术组和治疗组血管内膜下可见部分胞核呈棕黄色阳性着色,细胞凋亡率均明显高于假手术组(P＜0.01);血管中层可见少量TUNEL阳性细胞。第4周,手术组TUNEL阳性细胞比例较第2周时减少,而治疗组TUNEL阳性细胞数仍表达较多,细胞凋亡率明显高于手术组(P＜0.01)。见表2。

2.3 p53表达 正常组和假手术组偶见阳性细胞表达;第2周和第4周时,治疗组和手术组p53阳性细胞比例均明显高于假手术组(P＜0.01);第2周时,治疗组阳性细胞比例同手术组类似(P＞0.05),第4周时明显高于手术组(P＜0.01)。见表2。

表1 兔颈动脉内膜、中膜面积测定(mm2)

表2 TUNEL、p53免疫组化阳性率(%)

3 讨论

本实验中,高脂饮食兔的颈总动脉在空气干燥术后4周,可见内膜下增厚、管腔狭窄,说明动脉粥样硬化模型制作成功[3]。

有研究证明,血管损伤后2周内,平滑肌细胞的增生和凋亡处于相对平衡状态[4];2周后细胞凋亡基本停止,而增生继续,造成内膜增厚,管腔狭窄。AT RA治疗组细胞在4周仍有凋亡发生,使血管损伤后平滑肌细胞的增殖和凋亡处于一种相对平衡状态,从而抑制狭窄。ATRA作为一种具有广泛生物学效应的维生素A类衍生物,可明显抑制细胞增殖[5]。

细胞凋亡在动脉粥样硬化早期可减少细胞成分在内膜积蓄而防止内膜增厚,进展期则能清除斑块的炎症细胞并减少泡沫细胞形成,促进动脉粥样硬化的消退。p53是一种肿瘤抑制蛋白,具有促凋亡的作用,但在动脉粥样硬化中的作用一直有争论。有研究发现,血浆p53水平和颈动脉内膜厚度有关,冠心病患者冠脉粥样硬化斑块细胞中有p53的过度表达[6-7]。Sanz-González等发现,提高p53功能对机械损伤的内膜增生有抑制作用[8]。但p53诱导凋亡过程也可能带来纤维细胞减少,甚至促进斑块破裂[9]。单纯高脂饮食兔颈动脉内膜下基本没有p53阳性表达,而在空气损伤后的内膜下则出现了较高的阳性表达,说明单纯高脂血症引起的动脉粥样硬化斑块内细胞凋亡并不明显,而在内膜损伤后的斑块中细胞凋亡明显。实验中,治

疗组在第4周仍然有较高水平的p53表达,考虑ATRA诱导细胞凋亡可能是通过激活p53而实现的。针对血管损伤后细胞增殖过程中凋亡不足的干预治疗,有望成为治疗动脉粥样硬化及再狭窄的方法。但是血管细胞过度凋亡是否会引起斑块纤维帽变薄破裂,尚待进一步研究。

[1]Wå gsater D,Jatta K,Ocay a P,et al.Expression of IL-1 beta,IL-1 receptor typeⅠand IL-1 receptor antagonist in human aortic smooth muscle cells:effects of all-trans-retinoic acid[J].JVasc Res,2006,43(4):377-382.

[2]Fishman JA,Graeme BR,Morris JK,et al.Endothelial regeneration in the rat carotid artery and the significance of endothelial denudation in the pathogenesis of myointimal thickening[J].Lab Invest,1975,32(3):339-351.

[3]Ross R.The pathogenesis of atherosclerosis:a perspective for the 1990s[J].Nature,1993,362:801-809.

[4]Clowes AW,Reidy MA,Clowes MM,et al.Kinetics of cellular proliferation after arterial injury,Ⅰ:smooth muscle cell growth in the absence of endothelium[J].Lab Invest,1983,49:327-333.

[5]Herdeg C,Oberhoff M,Baumbach A,et al.Effects of local alltrans-retinoic acid delivery on experimental atherosclerosis in the rabbit carotid artery[J].Cardiovasc Res,2003,57(2):544-553.

[6]Bennet MR,Littlewood TD,Schwartz SM,et al.Increased ensitivity of human vascularsmooth muscle cells from atherosclerotic plaques to p53-mediated apoptosis[J].Circ Res,1997,(4):591-599.

[7]Chen W,Wang F,Li Z,et al.p53 levels positively correlate with carotid intima-media thickness in patients with subclinical atherosclerosis[J].Clin Cardiol,2009,32(12):705-710.

[8]Sanz-González SM,Barqu í n L,Garcí a-Cao I,et al.Increased p53 gene dosage reduces neointimal thickening induced by mechanical injury but has no effect on native atherosclerosis[J].Cardiovasc Res,2007,75(4):803-812.

[9]Yuan XM,Osman E,Miah S,et al.p53 expression in human carotid atheroma is significantly related to plaque instability and clinical manifestations[J].Atherosclerosis,2010,210(2):392-399.