8种头孢类抗菌药物无菌检查的方法学验证研究

王伟萍，李海芳，朱毅忠，曹艳玲（新疆维吾尔自治区食品药品检验所，乌鲁木齐 830004）

头孢类抗生素是β-内酰胺类抗生素中的一种，抗菌活性强，已成为临床抗感染治疗的主要药物，用量已占抗感染药物总用量的20%，并有继续增长趋势。建立该类抗生素注射用灭菌粉末的无菌检查方法，必须首先有效地消除其抑菌作用，才有可能检出制剂中污染的微生物，避免假阴性结果的发生。本试验采用薄膜过滤法，以不同冲洗量并且加入不同浓度的β-内酰胺酶以消除残留抗生素的抑菌活性，以期建立8种头孢类抗生素注射用灭菌粉末无菌检查方法并进行验证，同时对试验中应注意的问题进行了讨论。

1 材料

1.1 仪器

HTY-2000A型集菌仪、一次性全封闭集菌培养器（杭州高得医疗器械有限公司）；检验全过程在洁净度为100级的单向流空气区域内进行，其环境洁净度为10 000级，严格遵守无菌操作，同时做环境的动态测定。

1.2 培养基

硫乙醇酸盐液体培养基（批号：0211072）、0.1%蛋白胨水溶液（批号：060302）、青霉素酶（批号：20070320，规格：2 mL，纯度：＞300万u·mL－1）均购于中国药品生物制品检定所。

1.3 菌株

大肠埃希菌（Escherichia coli，批号：CMCC（B）44102）、金黄色 葡萄球 菌（Staphylococcus aureus，批号 ：CMCC（B）26003）、铜绿假单胞菌（Pseudomdnas aeruginosa，批号：CMCC（B）10104）、白色念珠菌（Candida albicans，批号：CMCC（F）98001）均购于中国药品生物制品检定所，制备成含菌数为10～100 cfu·mL－1的稀释液。

1.4 试药

（1）注射用头孢拉定（苏州益良药业有限公司，批号：20050501，规格：每支2.0 g）；（2）注射用头孢呋辛钠（浙江亚太药业股份有限公司，批号：060601，规格：每支1.5 g）；（3）注射用头孢曲松钠（石药集团中诺药业（石家庄）有限公司，批号：04108318，规格：每支1.0 g）；（4）注射用头孢哌酮钠（哈药集团制药总厂，批号：20041202，规格：每支1.0 g）；（5）注射用头孢哌酮钠/舒巴坦钠（浙江亚太药业股份有限公司，批号：060801，规格：每支2.0 g）；（6）注射用头孢他啶（海南海灵制药厂有限公司，批号：0602091，规格：每支1.0 g）；（7）注射用头孢唑啉钠（石药集团中诺药业（石家庄）有限公司，批号：06048009，规格：每支0.5 g）；（8）注射用头孢噻肟钠（乐山三九长征药业股份有限公司，批号：041101，规格：每支1.0 g）。

2 方法[1]

2.1 菌液与供试品的制备

分别取经37℃培养18～24 h的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌肉汤培养物10倍稀释为10～100 cfu·mL－1，备用；取经25℃培养18～24 h的白色念珠菌霉菌液体培养物用标准比浊管比浊，10倍稀释为10～100 cfu·mL－1，备用。

2.1.1 试验组：每种样品各取10支，以无菌操作将其溶解于250～500 mL的0.1%无菌蛋白胨水溶液中，并稀释至药液浓度约为20 mg·mL－1，作为供试液备检；取三联无菌检查用滤器，先用冲洗液（无菌0.1%蛋白胨水溶液）润湿滤膜，取250 mL供试液过滤，滤干后用冲洗液冲洗，每次冲洗100 mL，冲洗3～5次，滤干后分别灌注规定量的培养基，每筒分别加入150万u·100 mL－1或300万u·100 mL－1的青霉素酶，在阳性对照管中加入10～100 cfu的阳性菌悬液1 mL，按规定培养，逐日观察结果。

2.1.2 试验菌阳性对照组：不加样品及青霉素酶，只加阳性菌，其他操作同“2.1.1”项。

2.1.3 样品组：加样品及阳性菌，不加青霉素酶，其他操作同“2.1.1”项，该样品组具有抑菌作用。

2.1.4 阴性对照组：以稀释液替代样品液，冲洗液及冲洗量同“2.1.1”项，薄膜过滤后加入相同量的培养基。

表1 8种样品试验情况Tab 1 The growth state of 8 kinds of samples

图1 注射用头孢呋辛钠样品的金黄色葡萄球菌培养结果（每筒加入青霉素酶300万u、冲洗量300 mL）Fig 1 The growth state of Staphylococcus aureus in cefuroxime sodium for injection（300 mL fluid and 3 000 000 u of panicillinase）

图2 注射用头孢唑啉钠样品的金黄色葡萄球菌培养结果（每筒加入青霉素酶300万u、冲洗量300 mL）Fig 2 The growth state of Staphylococcus aureus in cefazolin sodium for injection（300 mL fluid and 3 000 000 u of panicillinase）

2.2 青霉素酶的加入量

在浓度为1∶100 mL的培养基中加入300万u青霉素酶，即1 mL青霉素酶原液；在浓度2∶100 mL的培养基中加入150万u青霉素酶，即0.5 mL青霉素酶原液。以3 d内滤器中培养基是否长菌为试验指标，观察不同浓度的青霉素酶液对各样品抑菌活性的消除效果。

2.3 冲洗次数

以2种不同的冲洗次数进行试验：（1）每次冲洗100 mL，冲洗3次；（2）每次冲洗100 mL，冲洗5次。观察冲洗次数对样品抑菌活性的影响。

3 结果

3.1 不同冲洗量对消除抑菌活性的影响

8种样品试验情况见表1（均为培养1～3 d后的观察结果，其中“＋”表示有菌生长，“－”表示无菌生长。

由表1可见，上述8种样品，在冲洗量为每筒500 mL、加酶量为每筒300万u的条件下，试验菌均在2 d内生长良好。但不同品种在培养相同时间内菌株的生长情况不同，如注射用头孢呋辛钠和注射用头孢唑啉钠在培养24 h后，注射用头孢呋辛钠样品的金黄色葡萄球菌（每筒300万u青霉素酶，冲洗量300 mL）生长良好，优于注射用头孢唑啉钠样品的金黄色葡萄球菌，照片见图1、图2。

另外，注射用头孢拉定、头孢呋辛、头孢哌酮钠/舒巴坦钠最敏感菌为大肠埃希菌，其余样品最敏感细菌为金黄色葡萄球菌。

3.2 相同冲洗量对消除抑菌活性的影响

在相同冲洗量下，不同加酶量对样品的抑菌活性的消除力不同，如注射用头孢他啶在500 mL的冲洗量下，加入300万u青霉素酶的大肠埃希菌株生长良好（培养48 h后），加入150万u青霉素酶的大肠埃希菌株未生长（培养48 h后），照片见图3。

4 讨论

无菌检查冲洗量过大，会造成滤膜损伤以及影响细菌细胞的渗透压，造成菌体死亡[2]。本方法采用酶抑制法消除抗菌作用，冲洗量控制在每筒500 mL，为既对滤膜损伤小又能有效清除抗生素残留的最佳冲洗量。同时，对于对β-内酰胺酶不稳定的抗生素，可在硫乙醇酸盐流体培养基中加β-内酰胺酶共同培养，此方法能使敏感菌在冲洗量较小时即良好生长。

本次试验中第2代的头孢呋辛钠对应的敏感菌为大肠埃希菌，第3代的头孢哌酮钠和头孢曲松钠对应的敏感菌为金黄色葡萄球菌。这可能是因为本次试验是先固定冲洗量再调整加酶量，与先固定加酶量再调整冲洗量所得出的敏感菌结果有所不同。加酶的顺序不同，其对菌体的作用机制可能不同，尚有待进一步研究。

为节省酶的用量，本次试验对加酶量进行了摸索。结果表明，注射用头孢拉定、注射用头孢呋辛钠、注射用头孢哌酮钠、注射用头孢哌酮钠/舒巴坦钠、注射用头孢他啶、注射用头孢唑啉钠、注射用头孢噻肟钠均需加酶每筒300万u，并且冲洗量需每筒300 mL；而注射用头孢曲松钠在加酶量每筒150万u、冲洗量每筒500 mL的条件下，阳性菌即可生长。

试验中应注意进行动态测定，记录动态结果，以保证试验环境的安全可靠。试验操作细节方面，根据笔者的试验体会，荡洗这一步非常必要，但操作时难免会沾湿滤筒上部通气孔上的膜。该膜沾湿后通透性会改变，将不能有效阻挡细菌，可能会影响试验结果，故建议将滤筒上部的小膜改为与下部滤膜相同的材质，建议中国药品检验标准操作规范（SOP）上可规定：“样品溶液快速滤过后，用冲洗液分次冲洗。每次加入50 mL（或100 mL）冲洗液，振摇荡洗滤筒后滤过。”

图3 注射用头孢他啶样品的大肠埃希菌培养结果A.每筒加入青霉素酶150万u、冲洗量500 mL；B.每筒加入青霉素酶300万u、冲洗量500 mLFig 3 The growth state of Escherichia coli in Ceftazidimefor injectionA.1 500 000 u of panicillinase，500 mL fluid；B.3 000 000 u of panicillinase，500 mL fluid

[1]国家药典委员会编.中华人民共和国药典（二部）[S].2005年版.北京：化学工业出版社，2005：附录ⅪH.

[2]张晓明，杜海娟，何晓英，等.抗菌素粉针剂无菌检查的最佳冲洗量及冲洗方法的实验研究[J].中国药品标准，2004，5（1）：56.