志贺氏菌属环介导恒温扩增快速检测方法的建立及初步应用

徐义刚，崔丽春，张昕哲，李苏龙，于恒纯，张子群，李丹丹

(1.黑龙江出入境检验检疫局检验检疫技术中心，黑龙江哈尔滨150001；2.东北林业大学，黑龙江哈尔滨150040；3.东北农业大学，黑龙江哈尔滨150030；4.海南出入境检验检疫局，海南海口570125)

志贺氏菌(Shigella)俗称痢疾杆菌，是一类引起人急性感染性痢疾的最常见病原菌。人主要通过食用被志贺氏菌污染的食品而感染发病，以全身中毒症状和大肠化脓性炎症为主要临床特征，具有公共卫生学意义[1]。建立志贺氏菌快速、准确、灵敏、特异的检测方法，不仅为及时有效控制食源性传染病提供依据，同时也是保障人类健康的必要手段。

目前，我国志贺氏菌属的检测方法主要采用国标法(GB/T4789.5-2003)，该方法主要为细菌分离和培养鉴定，操作繁琐，检测周期长，并且灵敏度低。其他检测方法，如ELISA、PCR、实时荧光PCR(real-time PCR)等，则存在检测灵敏度低(ELISA法)和检测仪器昂贵(real-time PCR仪)等问题[2-5]。Notomi等研发的环介导恒温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)，针对靶基因的6个区域设计4条特异引物，利用链置换DNA聚合酶在恒温条件作用40 min～60 min，即可完成核酸扩增反应，直接通过扩增副产物焦磷酸镁沉淀的浊度判断是否发生反应[6]。LAMP方法具有操作简便、检测快速、灵敏度高并且成本低廉等优点，在疾病诊断、病原检测等领域得到广泛应用[7]。本研究利用该项技术建立了志贺氏菌LAMP快速检测方法。

1 材料和方法

1.1 细菌株和主要试剂 实验菌株购自美国典型菌种保藏中心(ATCC)和中国医学微生物菌种保藏管理中心(CMCC)；分离株由本实验室分离并保存(表2)；TaqDNA Polymerase和甜菜碱购自Sigma公司；BstDNA Polymerase购自NEB公司；细菌基因组DNA提取试剂盒购自TaKaRa公司；复合增菌培养基、3%NaCl蛋白胨水和缓冲蛋白胨液(Buffered Peptone Water，BPW)均购自北京兰伯瑞生物技术公司。

1.2 引物设计 根据志贺氏菌属ipaH基因序列(M76445)，设计外引物 F3/B3及内引物 FIP/BIP、PCR引物和实时荧光PCR引物(表1)，引物及探针由TaKaRa公司合成。

1.3 基因组DNA的提取 将表2中细菌分别接种于复合增菌培养基(弧菌用3%NaCl蛋白胨水培养，其他菌株用BPW培养)中，按各细菌最适生长温度培养，分别采用煮沸法(LAMP特异性试验)和试剂盒法(LAMP灵敏度试验)提取基因组DNA。

1.4 LAMP反应条件 50 μL反应体系：10×ThermoPol Buffer 5 μL、 2.5 mmol/L dNTP 8 μL、100 mmol/L MgSO44 μL、 FIP/BIP(40 mmol/L)和F3/B3(20 mmol/L)各 1 μL、10 mmol/L 甜菜碱 4 μL、5 u/μLTaqDNA Polymerase 和 8 u/μLBstDNA Polymerase 2 μL、DNA 模板 1 μL。65 ℃水浴作用40 min～60 min，目测反应管中液体浑浊度变化，判断是否发生反应，同时进行琼脂糖凝胶电泳验证。

表1 LAMP、PCR和real-time PCR引物及探针序列Table 1 Primers and probe sequence for LAMP,PCR and real-time PCR

1.5 LAMP灵敏度试验 将浓度约为2.8×107cfu/mL的志贺氏菌进行10倍倍比稀释，提取DNA进行LAMP扩增，经琼脂糖凝胶电泳检测扩增效果，确定试验灵敏度。同时进行PCR及real-time PCR检测志贺氏菌灵敏度试验，PCR反应条件：95℃4 min；95℃ 30 s、58.5℃ 30 s、72℃ 40 s，30个循环；72℃5 min。Real-time PCR反应条件：37℃5 min；95℃ 3 min、94℃ 10 s、60℃ 40 s，40个循环。比较3种方法的检测灵敏度。

1.6 LAMP特异性试验 利用建立的LAMP方法检测表2中细菌基因组DNA，验证本方法的特异性。

1.7 污染食品LAMP方法检测灵敏度试验 取10 g无志贺氏菌的猪肉样品，加入90 mL碱性蛋白胨水，制成匀浆，加入1 mL菌体浓度约为3.5×107cfu/mL的志贺氏菌，取匀浆进行10倍倍比稀释，提取基因组DNA，进行LAMP扩增，经琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，以确定检测灵敏度。

1.8 临床样品检测及符合率试验 将志贺氏菌LAMP方法应用于检疫实践中，并与国标法进行比较，验证两者的符合率。

2 结果

2.1 志贺氏菌LAMP方法的建立 目测观察阳性反应管内部溶液变浑浊，表明产生了LAMP扩增副产物焦磷酸镁，即发生LAMP反应(图1：B-2)，而对照管溶液未变浑浊(图1：B-1)。经琼脂糖凝胶电泳验证，阳性反应管呈现典型的LAMP扩增电泳条带(图1：A-4、A-5)。采用荧光显色法检测，阳性反应管呈现典型的绿色荧光(图1：C-2)。

2.2 LAMP灵敏度试验 将已知浓度的志贺氏菌进行10倍倍比稀释，提取基因组DNA进行LAMP扩增，经凝胶电泳检测验证，该LAMP方法对纯培养菌的检测灵敏度为28 cfu/mL(图2)。

2.3 特异性试验 利用建立的LAMP方法对表2中32种共50株细菌进行检测，结果如表2所示，其中7株志贺氏菌为阳性，而其他菌为阴性，表明该方法具有高度特异性。

2.4 LAMP、普通PCR及real-time PCR法检测灵敏度比较 普通PCR和real-time PCR法检测志贺氏菌灵敏度如图3和图4所示。PCR法检测灵敏度为280 cfu/mL，real-time PCR方法检测灵敏度为28 cfu/mL。LAMP方法的检测灵敏度比普通PCR法高10倍，与real-time PCR方法的灵敏度基本相同。

2.5 污染食品志贺氏菌灵敏度检测结果 将含有志贺氏菌浓度3.5×105cfu/g的猪肉匀浆液进行10倍倍比稀释，以每个稀释度作为污染食品模型样本进行LAMP检测，经琼脂糖凝胶电泳分析，结果显示该LAMP方法对污染食品中志贺氏菌的检测灵敏度为 35 cfu/mL(图 5)。

表2 志贺氏菌LAMP方法特异性试验菌株及检测结果Table 2 Bacteria strains and detection results for specificity of LAMP assay ofShigella

2.6 临床样品检测及符合率试验 2009年4月至2009年11月期间，利用LAMP方法对195份涉及肉类、奶类、豆制品及人工污染样品进行检测，共检出29份阳性，与国标法检测结果符合率为100%(表3)，表明该LAMP方法具有良好的可靠性。

表3 LAMP方法与国标法对比结果Table 3 Comparison between LAMP method and bacteria isolation and identification

3 讨论

本研究利用环介导等温扩增技术建立的志贺氏菌属LAMP检测方法，操作方便，40 min～60 min内即可完成致病菌检测，可以满足食源性致病菌快速检测的要求，实验装置简单，结果判断直观，具有广泛应用价值。

利用该LAMP方法对包括志贺氏菌在内的32种共50株细菌进行检测，结果显示其中7株志贺氏菌为LAMP阳性，而其他细菌为阴性，表明该LAMP方法具有高度特异性。为确定该方法的检测灵敏度，对已知浓度的致病菌进行10倍倍比稀释，提取每个稀释度细菌基因组DNA作为模板进行LAMP扩增，琼脂糖凝胶电泳检测显示，该LAMP方法对纯培养的志贺氏菌检测灵敏度可达28 cfu/mL，对污染食品中志贺氏菌的检测灵敏度为35 cfu/mL，能够满足食源性致病菌检测限量要求。此外，本研究比较了该LAMP方法与普通PCR法及real-time PCR法检测志贺氏菌的灵敏度，结果显示该方法检测灵敏度较PCR法高10倍，而与real-time PCR方法检测灵敏度基本相同。检验检疫实践证实，该LAMP方法与国标法检测结果的符合率为100%，表明了该方法的可靠性。从实验易操作性、结果判定直观、低成本的角度出发，该LAMP方法具有较好的应用前景。

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