羊传染性脓疱病毒的分离鉴定

迟 源，王 好*，钱爱东

(1.吉林农业大学动物生产及产品质量安全教育部重点实验室，吉林长春130118；2.吉林农业大学动物科学技术学院，吉林长春130118)

羊传染性脓疱病(Contagious ecthyma)是由羊传染性脓疱病毒(Orf virus)引起的一种人畜共患、接触性、嗜上皮性传染病，俗称羊口疮(Orf)。近些年来该病呈现重新流行的趋势，世界各地都相继报道了该病的流行[1-3]。范春玲等报道了我国2006年北京市亚福动物养殖中心暴发该病，传播速度快，发病率高达95.4%[4]。Orf病毒的开放阅读框ORF059基因即F1L基因，与痘苗病毒的H3L基因具有一定的同源性[5]，其编码的39 ku蛋白是囊膜蛋白[6]，与病毒吸附和穿入宿主细胞有关，是刺激宿主免疫应答的主要抗原之一[7]，ORF027基因表达病毒核蛋白。因此，本实验对采自吉林省榆树市的疑似本病的羊痂皮病料进行了病毒分离鉴定，并对该分离株的ORF027基因、ORF059部分基因进行克隆、序列分析以及构建系统进化树，旨在为研究本病的流行规律和新型疫苗研制奠定其生物学基础。

1 材料和方法

1.1 病料来源 吉林省榆树市2007年自然感染、临床疑似Orf的病羊，无菌采集其口唇部痂块组织。

1.2 主要试剂 ExTaqDNA聚合酶、E.coliDH5α及pMD18-T载体均购自TaKaRa公司。质粒提取试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒购自杭州维特洁生化技术有限公司。

1.3 病毒分离

1.3.1 病料处理 无菌采集的痂块称重、研磨，按1∶5(W/V)比例加入 PBS制成悬液，加入双抗2000IU/mL，置4℃过夜，离心取上清液，-20℃保存。

1.3.2 病毒的分离培养 无菌摘取新生健康犊牛睾丸，以0.25%胰蛋白酶37℃消化制备单个细胞，37℃、5%CO2培养。挑选生长致密单层细胞消化制成悬液，加入处理的病毒液0.5 mL及5%血清浓度的MEM营养液，37℃培养，另设空白细胞作对照，当出现75%的细胞病变(CPE)时收毒。

1.4 分离病毒的鉴定

1.4.1 形态观察 将反复冻融2次的病毒细胞培养物离心，取沉淀物用20 g/L的磷钨酸作常规负染，置透射电子显微镜下观察并拍照。

1.4.2 PCR引物的设计 参照GenBank中登录的Orf病毒的ORF027、ORF059基因序列，设计了2对引物。P1：5'-GGCGATGG AGGCGATTA-3'，P2：5'-TCGACCCCGCGAAGGT-3'， P3： 5'-GCGGTGGA ATGGAAAGA-3'， P4： 5'-AGCAGGTATGCCAGGA TG-3'。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.4.3 PCR扩增 病毒基因组提取：将出现病变的细胞培养物反复冻融2次，加入SDS和蛋白酶K至终浓度分别为5 mL/L和200 μg/mL消化，以Tris平衡酚溶液、氯仿-异戊醇(24∶1)溶液抽提细胞基因组DNA，溶于TE缓冲液中。

PCR反应的总体系为25 μL：10×PCR Buffer 2.5 μL ； dNTPs(各 2.5mmol/μL)2.0 μL ； ExTaq DNA 聚合酶 (5 u/μL)0.25 μL；P1(20 pmol/μL)0.5 μL；P2(20 pmol/μL)0.5 μL；模板 DNA 1.0 μL；灭菌去离子水18.25 μL。PCR反应条件：95℃5 min，94℃45 s，51.6℃ (ORF027)或 48.2℃ (ORF059)40 s，72℃40 s，30个循环，72℃10 min。扩增产物于1%琼脂糖凝胶电泳。

1.4.4 目的基因的克隆与测序 采用DNA凝胶回收试剂盒对回收的目的DNA进行纯化，纯化的PCR产物与pMD18-T载体连接，构建重组质粒，转化DH5α感受态细胞，在含有氨苄青霉素的LB琼脂平板上筛选单菌落，接种于含氨苄青霉素的LB培养基中，200 r/min振荡培养过夜。提取重组质粒，经琼脂糖凝胶电泳、PCR方法鉴定正确的阳性重组质粒进行序列测定。

1.4.5 序列比较分析及进化树绘制 利用DNAStar软件将测定结果与国内外具有代表性的参考毒株进行序列同源性分析并构建系统进化树。

2 结果与讨论

2.1 病毒分离 细胞接种病毒48 h后，开始有少量的细胞聚集、悬浮，72 h时在局部出现贴壁细胞变圆，肿胀，病变部位上方可见脱落的细胞团。随着时间延长，病变部位扩大，出现大片网状结构，第6 d CPE达到70%时收毒；而对照细胞生长正常。病毒培养过程中产生的CPE与詹述宣等描述的特征基本一致[8]。该病毒产生CPE的相关报道中CPE出现及产生的时间差异很大，从几个小时到2 d。本实验发现，随着分离株较快地适应犊牛睾丸细胞，并且传代次数增加，其CPE更加规律。这表明在一定代数内，随着传代次数的增多，分离株对犊牛睾丸细胞的适应性增强。

2.2 电镜结果 电镜下观察到了典型的Orf病毒粒子，大小约为200 nm，病毒表面有特征性的管状结构，这些管状结构斜向平行地从病毒粒子的长轴从上向下由左至右盘旋(图1)，与文献描述相符[9]。将该Orf病毒分离株命名为Orf-ys。

2.3 病毒基因克隆及鉴定 将病毒基因组的PCR扩增产物克隆于pMD18-T载体中，通过琼脂糖凝胶电泳及PCR鉴定，均得到一致结果。鉴定正确的重组质粒进行测序，结果证实插入的DNA片段大小为446 bp、704 bp，与预期设计完全一致。

2.4 序列比较及分析 利用DNAStar软件将测序结果与Genbank中登录的Orf病毒不同毒株进行序列比较分析。结果表明，ORF027基因与参考毒株的核苷酸序列同源性为97.6%～98.6%，同源性最高的为美国OV-IA82株，证明该基因较为保守；氨基酸序列分析表明，分离株有3个氨基酸位点发生突变：分别为第53位E变成G，第79位E变成D，第128位D变成E。这些氨基酸间的差异是否影响其病毒的毒力或分型则有待于深入研究。ORF059基因与参考毒株的核苷酸序列同源性为96.9%～98.4%，与Orf病毒OV/C2株同源性最高。核苷酸序列未发生较大改变，表明不同毒株的这段基因相对比较保守，变异率较低。

2.5 遗传进化关系 将所测定的Orf-ys分离株的两段基因与国内外发表的毒株相应片段作序列比较，应用软件所计算的遗传距离绘制系统进化树(图2与图3)，ORF027基因进化树结果显示，Orf-ys分离株形成独立的进化分支，并与美国OV-IA82株亲缘关系较近。ORF059基因进化树结果显示，Orf-ys分离株与意大利OV/C2、OV/mi-90株亲缘关系较近。

本研究利用犊牛睾丸细胞从自然发病羊的痂皮材料中成功地分离了1株Orf病毒，并根据其核酸序列分析了该分离株与其它参考病毒株的差异、分析其基因的遗传起源，为本病流行规律的探索和新型疫苗研制奠定了基础。

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