96孔板－PCR排除法筛选猪蛔虫雌虫卵黄蛋白原基因

魏冬霞，邓 艳，吴绍强，林瑞庆，宋慧群，朱兴全

(1.江苏畜牧兽医职业技术学院动物医学院，江苏泰州225300；2.华南农业大学兽医学院，广东广州510642；3.广州机场出入境检验检疫局综合实验室，广东广州510470；4.中国检验检疫科学研究院，北京100029)

猪蛔虫病是由蛔科(Ascaridae)的猪蛔虫(Ascaris suum)寄生于猪小肠引起的一种线虫病。该病不仅给养猪业造成严重经济损失，而且由于猪蛔虫感染性幼虫还会引起人的眼幼虫移行症和内脏幼虫移行症，对人类健康构成危害[1-2]。由于猪蛔虫产卵量大，虫卵对外界环境抵抗力强等因素，从而造成猪蛔虫病的广泛流行。卵黄蛋白原(VIT)为雌性肠道上皮细胞合成的一种具有脂类结合能力的蛋白质，它可以通过受体介导的细胞内吞作用进入卵巢中的胚胎内，为后代的发育提供能量。如能选择性地抑制或阻断猪蛔虫雌虫VIT基因的表达，则可抑制成虫的繁殖及产卵，从而有效地控制猪蛔虫病的传播和流行。本研究以猪蛔虫雌虫VIT基因的EST序列为模板设计引物，对猪蛔虫雌虫cDNA文库进行筛选，并获得了猪蛔虫VIT基因序列，为该基因的深入研究奠定基础。

目前用于文库筛选的方法很多，传统的文库筛选方法包括原位杂交筛选、抗体筛选和功能表达筛选。这些方法的缺点是消耗材料多，并且费时费力。而以PCR为基础的筛选文库方法具有许多优势[3-5]。本研究利用PCR法和排除法相结合的96孔板-PCR排除法对猪蛔虫雌虫的cDNA文库进行筛选，获得了猪蛔虫雌虫VIT基因序列。

1 材料和方法

1.1 cDNA扩增文库和阳性对照菌 猪蛔虫雌虫cDNA文库由华南农业大学寄生虫学研究室构建[6]，文库扩增后滴度达3×109cfu/mL，插入片段在0.7 kb～2 kb之间，平均插入片段长度1.2 kb，每孔原始克隆数约为1800个；阳性对照重组菌F993(试验编号)系经抑制消减杂交方法筛选出的猪蛔虫雌虫差异表达的cDNA插入pGEM-T载体(Promega)中，转化E.coliJM109感受态细胞[7]，该重组菌株由本实验室制备并保存。

1.2 主要试剂和引物 DL-2000 DNA Marker和TaqDNA聚合酶购自宝生物工程(大连)有限公司。

根据重组菌株F993的EST序列设计引物，其序列为：F993UP：5'-ACGACGAGGAGTGCGAC AT-3'； F993DOWN： 5'-GTAGAGCGAGGCAGACA AG-3'，扩增产物为274 bp。由北京赛百盛基因技术有限公司合成。

1.3 PCR反应条件 PCR扩增条件：94℃5 min；94℃30 s、55℃30 s、72℃30 s，35个循环；72℃5 min。

1.4 cDNA文库的初步筛选 分别取1 μL保存于96孔细胞培养板上的扩增文库在96孔PCR反应板中进行PCR扩增，同时设阳性对照(克隆F993的菌液)和空白对照，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。

1.5 cDNA文库分部排除筛选

1.5.1 分板排除非阳性克隆 取含有阳性克隆的扩增文库10 μL，用LB液体培养基进行10倍倍比稀释，分别取1 μL稀释液进行PCR检测，确定可检测到阳性条带的最大稀释倍数。然后取1 μL含阳性克隆的最大稀释倍数的稀释液(即可检测到阳性信号的最大稀释倍数的下级稀释液50 μL)铺含有氯霉素的LB培养板，37℃过夜培养。平板上的菌落分别用LB液体培养液洗脱菌落，并对收集的菌液进行PCR检测，确定含阳性克隆的洗液。

1.5.2 分区排除非阳性克隆 将含阳性克隆的洗液按上述方法进行稀释，PCR检测和铺板培养。收菌时每板分4～6区收取单菌落。如此经几轮筛选，直到能确保在100个以下的克隆里含有1个阳性克隆为止。

1.6 阳性克隆的鉴定 直接挑取经筛选后的克隆进行PCR鉴定；或者将每板上的菌落按每10个～20个克隆分区，每区的克隆挑在同1个培养管中，37℃，170 r/min过夜培养，然后进行菌液PCR确定含阳性克隆的区，最后再挑取原板中阳性区的单克隆到800 μL LB液体培养基中，加入氯霉素后37℃过夜培养。分别取1 μL单克隆菌液做模板进行PCR，鉴定出阳性克隆。最后鉴定阳性克隆插入片段的大小。将检测到的克隆菌液进行扩繁与鉴定后测序，并对该序列进行初步分析。

2 结果与讨论

2.1 cDNA文库的初步筛选结果 初步筛选扩增文库(保持于96孔板上)，结果见图1。选取阳性信号较强的孔G10做下一步筛选。结果显示，几乎所有的孔均为阳性，表明该基因是高丰度基因，这与吴绍强等从猪蛔虫雌虫和雄虫的抑制消减文库中挑出的随机克隆测序结果相符[7]，表明该基因在猪蛔虫雌虫中呈高表达状态。

2.2 分部排除筛选cDNA文库

2.2.1 含阳性克隆最大稀释倍数的确定 从G10孔中取10 μL原扩增文库分别做10倍系列稀释后进行PCR检测，结果显示检测到阳性信号的最大稀释倍数为 104(图 2)。

2.2.2 含阳性克隆板的确定 将收集的菌液做PCR，经琼脂糖凝胶电泳检测确定含强阳性克隆的培养板为板3和板5(图 3)。

2.3 阳性克隆的鉴定 取上述105倍的稀释液再进行涂板、培养、收菌、PCR鉴定，经几轮筛选后，最后得到64个菌落，经鉴定菌落A10为强阳性，编号为 F993-G10-A10(图 4)。

2.4 基因序列分析 阳性克隆F993-G10-A10测序结果显示，其序列长621 bp，有完整的3'端。在线BLAST分析表明该序列与秀丽新杆线虫的VIT基因家族成员(Vit1、Vit2、Vit3、Vit4和Vit5)有一定同源性。其推导的氨基酸序列与秀丽隐杆线虫的VIT基因家族成员的氨基酸序列一致性分别为35%、35%、34%、34%和35%，相似性分别为55%、57%、54%、54%和53%。在EST数据库中经BLASTn分析，在与其相匹配的序列中，E值小于2e-31的有47条，这些EST序列均来源于猪蛔虫，它们的功能也相似于秀丽隐杆线虫的VIT。该基因已录入 GenBank(AM262190)。

本研究根据从猪蛔虫雌虫抑制消减文库中选取的特异性EST序列设计引物，运用96孔板-PCR排除法对猪蛔虫雌虫cDNA文库进行筛选，获得了猪蛔虫雌虫VIT基因。该阳性克隆的获得为该基因的进一步研究奠定了基础。同时，也证明了96孔-PCR排除法是一种特异、高效、简便、成本低的筛选文库方法。

[1]汪世平.医学寄生虫学[M].北京：高等教育出版社，2004.

[2]Inatomi Y,Murakami T,Tokunaga M,et al.Encephalopathy caused by visceral larva migrans due toAscaris suum[J].J Neu Sci,1999,164(2):195-199.

[3]徐碧玉，苏伟，张建斌，等.香蕉果实SMART cDNA文库的构建及利用PCR方法筛选香蕉Actin2基因[J].热带亚热带植物学报，2005，13(5)：375-380.

[4]Israel D I.A PCR-based method for high stringency screening of DNA libraries[J].Nucleic Acid Res,1993,21:2627-2631.

[5]Munroe D J,Loebbert R,Bric E,et al.Systematic screening of an arrayed cDNA library by PCR[J].Proc Natl Acad Sci USA,1995,92:2209-2213.

[6]魏冬霞，邓艳，吴绍强，等.用SMART技术构建猪蛔虫雌虫 cDNA文库[J].中国预防兽医学报，2007，29(3)：180-184.

[7]吴绍强，邹丰才，翁亚彪，等.利用抑制消减杂交技术筛选猪蛔虫性别差异表达基因[J].中国农业科学，2005，38(6)：1040-1045.