鸭源大肠杆菌O78菌蜕的制备及免疫原性研究

吕敏娜，覃宗华，余劲术，袁建丰，孙铭飞，吴彩艳，蔡建平

(广东省农业科学院兽医研究所广东省兽医公共卫生实验室，广东广州 510640)

埃希氏大肠杆菌(Escherichia coli)是一种血清型多样、能感染各种动物和人类并引起严重疾病的革兰氏阴性菌。由于抗生素的滥用/误用，导致E.coli耐药性菌株不断出现，给养殖业造成严重的经济损失，对动物和人类的健康都造成了危害，因此，免疫预防已成为防治E.coli病的首选方法。

细菌菌蜕(Bacterial ghost)是指缺乏细胞浆和核酸的无活力细菌菌(壳)体[1-2]，是在噬菌体phiX174的裂解基因E所表达的裂解蛋白作用下，在G-细菌细胞膜上形成直径约40 nm～200 nm的特异性跨膜孔道，在渗透压差的作用下，细菌的胞质内容物由孔道流出[3-4]，从而产生的细菌空壳。菌蜕完好地保留了菌体表面的各种抗原结构和粘附活性，可以类似活菌体诱导机体产生良好的免疫保护反应[5-6]。菌蜕技术被认为是研究开发新型基因工程疫苗的技术平台[7-8]。本研究通过构建鸭源E.coliO78/pHH43菌蜕及其免疫原性的试验研究，为进一步研制非变性灭活基因工程菌蜕疫苗奠定了基础。

1 材料和方法

1.1 主要材料 含有E基因的裂解重组质粒pHH43为本研究室保存；鸭源E.coliO78为本课题组从广东省珠三角地区某发病鸭场分离、鉴定并保存的菌珠；庆大霉素、氯霉素均购自上海生工生物工程服务有限公司；实验雏鸭购自广州市郊某养鸭场。

1.2 E.coliO78/pHH43菌蜕的制备

1.2.1 质粒pHH43转化E.coliO78将pHH43转化氯化钙法制备的感受态E.coliO78后，以含氯霉素(34 μg/mL，以下同)的LB琼脂平板进行筛选，挑取单菌落于含氯霉素的LB液体培养基中培养。所筛选阳性转化菌命名为E.coliO78/pHH43。

1.2.2 E.coliO78/pHH43菌蜕的制备 E.coli O78/pHH43接种含氯霉素的LB平板上，28℃恒温培养过夜；挑取单菌落于3 mL含氯霉素的LB液体培养基中，28℃200 r/min振荡培养过夜，次日取1 mL转接于30 mL LB液体培养基中，28℃200 r/min培养至OD600nm为0.4～0.5时，升温至42℃，诱导4 h。其间每隔1 h取样，测定OD600nm及活菌数，观察其诱导结果。

1.2.3 裂解效率观察 将诱导后E.coliO78/pHH43菌蜕做如下处理：一是直接冻干；二是以PBS洗涤3次，5000 r/min，10 min，定容到原体积后进行冻干。冻干后用同体积的LB液体培养基重悬，各取冻干前、后的菌液进行活菌计数，按失活率=(1-冻干后活菌数/冻干前活菌数)×100%计算失活率。

冻干后重悬的E.coliO78/pHH43菌液分别添加不同浓度的庆大霉素(62 μg/mL～150 μg/mL)，室温作用1 h后，分别涂布LB平板(含上述浓度氯霉素，100 μL/板)，37℃恒温箱培养16 h，确定使未裂解存活菌完全失活的庆大霉素浓度。

1.3 鸭源E.coli菌蜕的免疫原性研究

1.3.1 抗原的制备 E.coliO78/pHH43菌蜕的制备：将诱导4 h的E.coliO78/pHH43菌液用PBS洗涤3次，冻干后重悬，添加庆大霉素(124 μg/mL)，经无菌检验合格，即为E.coliO78/pHH43菌蜕，置4℃保存备用。

E.coliO78福尔马林灭活菌苗：E.coliO78菌液加入福尔马林灭活，经无菌检验合格后，加入蜂胶佐剂(10 mg/mL)，置4℃保存备用。

1.3.2 实验动物和免疫方法 试验组1：E.coliO78/pHH43菌蜕以不同剂量4×109cfu/只、6×109cfu/只、8×109cfu/只、1×1010cfu/只和 1.2×1010cfu/只分别接种7日龄雏鸭，30只/组，观察免疫保护效果。

试验组2：E.coliO78/pHH43菌蜕与E.coliO78传统灭活苗均以8×109cfu/只剂量免疫7日龄雏鸭，30只/组，比较保护效果。

以上两组均于免疫后14 d，E.coliO78腿部肌肉注射攻毒(2×108cfu/只)，观察临床反应，并于攻毒后7 d迫杀存活鸭，剖检观察病变。按免疫保护(RPS)=(1-免疫组死亡数/对照组死亡数)×100%公式计算免疫保护率。

2 结果

2.1 E.coliO78/pHH43菌蜕的制备 E.coliO78/pHH43在28℃，200 r/min条件下培养至OD600nm为0.4～0.5时，立刻升温至42℃进行诱导，随诱导时间OD600nm值不断上升，但其活菌数却下降，裂解百分率升高，诱导4 h后基本处于平稳状态(图1)。

经直接冻干及洗涤3次后进行冻干处理，分别取冻干前及冻干后重悬的菌液作稀释，各取100 μL涂平板计数。结果显示，冻干并不能使活菌100%失活(表1)。因此，需要进一步添加庆大霉素使其完全灭活。结果表明庆大霉素的终浓度为124 μg/mL时能够使未裂解的存活菌100%灭活。

2.2 动物试验结果 第一组E.coli O78/pHH43菌蜕免疫组以1×1010cfu/只免疫7日龄雏鸭可获得100%的免疫保护，以8×109cfu/只免疫剂量获得87.5%的免疫保护(表2)。第二组E.coli O78/pHH43菌蜕与E.coli O78传统灭活苗组攻毒后结果表明：E.coli O78/pHH43菌蜕与E.coli O78传统灭活苗对雏鸭均有免疫保护效果，但E.coli O78/pHH43菌蜕免疫保护率为87.5%，稍高于传统的甲醛灭活菌苗的免疫保护率 75%(表 3)。

表1 E.coliO78/pHH43菌蜕冻干结果Table 1 Inactivating effect ofE.coliO78/pHH43 bacterial ghost by lyophilized method

表2 E.coliO78/pHH43菌蜕不同免疫剂量的免疫保护效果Table 2 E.coliO78/pHH43 bacterial ghost of different doses of immune protective effect

3 讨论

编码phiX174噬菌体E裂解基因的重组质粒可在温敏阻遏元件c1857的控制下进行E基因的限制性表达，在温度低于30℃时，阻遏蛋白c1857的表达可使E基因的表达得以很好抑制；而当温度高于30℃时，阻遏蛋白c1857发生热失活，解除对E基因表达的抑制导致发生菌体的裂解作用，并且在42℃达到最大的裂解效应。利用这一原理，本实验以雏鸭为实验动物，以鸭源致病性E.coliO78为试验菌，将带有E裂解基因的重组质粒pHH43转化至此宿主菌，并经热诱导方法制备了E.coli菌蜕。

表3 E.coli菌蜕与传统灭活疫苗的免疫保护效果比较Table 3 Comparison of protective effect betweenE.coli bacterial ghost and traditional inactivated of vaccine

含有E基因的裂解质粒pHH43转化于致病性E.coliO78后，42℃诱导，菌液OD600nm值持续呈上升趋势，与常月红报道的胸膜肺炎杆菌菌蜕在升温诱导后，菌液OD600nm值始终无明显的升高或下降，整体曲线非常平缓的试验结果不一致，这是否与宿主菌的固有性状有关，有待进一步探讨[9]。

菌蜕的诱导不能完全裂解宿主菌，未被裂解的存活菌膜上存在E蛋白，在冻干时易破裂，因此冷冻干燥可让其灭活。本实验将致病性E.coliO78/pHH43菌蜕冷冻干燥也未能使其完全灭活，加入庆大霉素124 μg/mL(终浓度)后使其完全灭活。

菌蜕与传统灭活苗相比，没有福尔马林对机体的不良刺激，菌蜕本身具有佐剂效应[10-11]；菌蜕缺乏遗传物质，因此作为疫苗进入动物体内后，消除了耐药基因或毒力岛基因的水平转移引起的潜在风险，比传统灭活疫苗(含细菌全部DNA)具有更高的生物安全性。

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