HPLC法测定人血浆中双嘧达莫的浓度

李晓苗，李源，谢永宏（1.第四军医大学西京医院内分泌科，西安市7100；.第四军医大学口腔医院麻醉科，西安市 7100；.第四军医大学唐都医院呼吸科，西安市 71008）

双嘧达莫又名潘生丁，因其具有扩张冠状动脉及抗血小板聚集功能，临床主要用于预防和治疗心绞痛、心肌梗死和血栓栓塞性疾病[1，2]。随着双嘧达莫在临床的广泛应用，对其研究也不断增多，笔者建立了一种简单、快速、灵敏的高效液相色谱法测定双嘧达莫的血药浓度，可用于双嘧达莫临床血药浓度测定及药动学、生物等效性的研究。

1 材料

1.1 仪器

10A series高效液相色谱仪，包括LC-10Avp二元泵、SPD-10Avp紫外检测器、Class-VP工作站（日本岛津公司）；TG16-WS高、低速离心机（上海沪湘仪器有限公司）；涡旋混合器（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）。

1.2 试药

双嘧达莫标准品（中国药品生物制品检定所，纯度：99%）；内标：地西泮注射液（上海旭东海普药业有限公司，规格：2 mL∶10 mg，批号：070102）；乙腈为色谱纯，三乙胺、冰醋酸、醋酸铵均为分析纯；所有试验用水均为双重蒸馏水；空白血浆由第四军医大学西京医院输血科提供。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Shim-pack VP-ODS C18（50 mm×4.6 mm，5 μm），ODS预柱（10 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈∶0.02 mol·L－1醋酸铵（含0.25%三乙胺，冰醋酸调pH值至5.6）＝40∶60；流速：1 mL·min－1；检测波长：283 nm；柱温：30℃；进样量：20 μL。

2.2 双嘧达莫标准溶液的制备

准确称取双嘧达莫标准品12.5 mg，置于25 mL容量瓶中，加入适量甲醇使之溶解并稀释至刻度，摇匀，制得浓度为500 μg·mL－1的双嘧达莫标准贮备液。将该贮备液以甲醇稀释，制备成浓度分别为0.4、1.0、2.0、5.0、10、20、40、100、200 μg·mL－1的双嘧达莫标准溶液。

2.3 内标溶液的制备

精密量取地西泮注射液1 mL，置于50 mL容量瓶中，以甲醇溶解并定容，得浓度为100 μg·mL－1的内标贮备液。

2.4 血浆样品的处理

量取空白血浆0.4 mL，置于10 mL具塞离心管中，加入0.1 mol·L－1氢氧化钠（NaOH）溶液 0.5 mL，涡旋混合30 s后加入内标溶液10 μL，涡旋混合30 s。加入乙醚3 mL涡旋混合3 min，4 500 r·min－1离心10 min。分离有机层，室温下N2吹干。残渣加入流动相100 μL涡旋混合30 s使之溶解，10 000 r·min－1离心10 min，取上清液20 μL进样分析。

2.5 标准曲线的制备

量取空白血浆0.4 mL，置于10 mL具塞离心管中，分别加入不同浓度双嘧达莫标准溶液10 μL，混匀，使其血药浓度分别为10、25、50、125、250、500、1 000、2 500、5 000 ng·mL－1，按“2.4”项下方法操作测定，每一浓度进样3次，取平均值。以浓度（X）为横坐标，双嘧达莫与内标峰面积比（Y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程为Y＝0.006+0.036X（r＝0.999 0），结果表明，双嘧达莫血药浓度在10～5 000 ng·mL－1范围内线性关系良好。血浆中双嘧达莫的定量下限为10 ng·mL－1。

2.6 方法专属性考察

在本色谱条件下，血浆中内源性物质不干扰待测物和内标物的测定，并且峰形良好。双嘧达莫、内标地西泮保留时间分别约为8、17 min。色谱图见图1。

图1 高效液相色谱图A.空白血浆；B.空白血浆+内标；C.空白血浆+双嘧达莫标准品+内标；1.双嘧达莫；2.地西泮Fig 1 HPLC chromatogramsA.blank plasma；B.blank plasma+diazepam；C.blank plasma+dipyridamole control+diazepam；1.dipyridamole；2.diazepam

2.7 回收率试验

分别在0.4 mL空白血浆中加入低、中、高3种浓度的双嘧达莫标准溶液10 μL，混匀，使其血药浓度分别相当于25、500、5 000 ng·mL－1，按“2.4”项下方法操作，将双嘧达莫峰与内标峰面积之比（Y）代入标准曲线计算双嘧达莫血药浓度，并以测得值与加入值之比计算方法回收率，结果见表1。另以流动相配制相应系列浓度的双嘧达莫溶液，不经提取直接测定，以此为标准，将2组峰面积相比，计算得双嘧达莫提取回收率，结果见表1。

表1 回收率及精密度试验结果（n＝5）Tab 1 Results of precision and recovery test（n＝5）

2.8 精密度试验

同“2.7”项下方法制备，使血浆中双嘧达莫溶液浓度分别为25、500、5 000 ng·mL－1，每个浓度平行制备5份样品，按“2.4”项下方法操作。进样分析计算日内精密度；依上述方法，连续测定3 d，计算日间精密度，结果见表1。

2.9 稳定性考察

同“2.7”项下方法制备，使血浆中双嘧达莫溶液浓度分别为25、500、5 000 μg·mL－1，于－20 ℃冷冻保存，反复冻融3次，分别按“2.4”项下方法操作，测定血浆中双嘧达莫浓度，考察其稳定性，结果表明血浆中双嘧达莫在－20℃冷冻保存，反复冻融3次后稳定性符合要求（RSD均＜6%）。同“2.7”项下方法制备上述3种浓度的标准血浆，按“2.4”项下方法处理后分别于0、6、24 h时进样测定，结果表明处理后的血浆中双嘧达莫在24 h内稳定性良好（RSD均＜6%）。同“2.7”项下方法制备上述3种浓度的标准血浆，分别于0、6、24 h时按“2.4”项下方法处理标准血浆，进样测定，结果表明室温下血浆样品稳定性良好（RSD均＜4%）。

3 讨论

在选择流动相时，分别选用了甲醇-磷酸二氢钠、乙腈-磷酸二氢钠、甲醇-醋酸铵、乙腈-醋酸铵，经比较发现选用乙腈-醋酸铵时峰形较好，与血浆中内源性杂质、内标可完全分离，分离度大于2，且保留时间适宜。

本试验筛选了大量的内标物，结果发现流动相为乙腈-0.02 mol·L－1醋酸铵（含0.25%三乙胺，冰醋酸调pH值至5.6）时，选用地西泮为内标与双嘧达莫的分离度最好，保留时间适宜。

对于双嘧达莫的提取方法，分别选用乙醚、乙酸乙酯、氯仿为提取剂，经过比较，乙醚提取率较高，且杂质较少，峰形较好，易于N2吹干；乙酸乙酯和氯仿提取回收率较低，杂质较多，不易于N2吹干，比较耗时。同时考察了乙醚的用量对回收率的影响，发现乙醚用量为3 mL时比1.5 mL提取率高，而与5 mL相比无显著性差异。因此将乙醚定量为3 mL。本法使用乙醚1次提取即可使回收率达85%以上，节省了试验时间。在提取过程中，将样品分别振荡1、3、5 min，结果表明，振荡3 min提取率高于1 min，与5 min相比无显著性差异。

本文建立的高效液相色谱法测定双嘧达莫血药浓度准确、灵敏、特异、稳定，适用于双嘧达莫在人体内的药动学和生物利用度研究。

[1]陈新谦，金有豫，汤 光主编.新编药物学[M].第15版.北京：人民卫生出版社，2003：268.

[2]Julie H，Robert AO.Drugs used in disorders of coagulation[A].Katzung BG.Basic&Clonical Pharmacology[M].8th edn.Beijing：The McGraw-Hill Companies，2001：564.