银杏达莫联合针灸通过Nrf2/HO-1通路促进大鼠创伤性脑出血后神经功能恢复的作用机制研究

潘 亮，田守森，田雯艳

创伤性脑出血(traumatic intracerebral hemorrhage， TICH)引起的缺氧脑水肿会引起氧化应激反应和炎症反应，进而损伤脑神经元并引起神经元凋亡，导致神经功能的损伤[1]。近年来临床研究发现中医中药在治疗TICH脑出血以及保护神经功能中有巨大作用，银杏达莫的主要成分为银杏黄酮苷、萜类内酯及双嘧达莫等，作为一种复方制剂，具有强大的调节氧化应激和抗炎作用，并且研究已经发现银杏达莫在治疗TICH中的作用[2]。此外，银杏达莫也具有促进TICH患者神经功能恢复的作用[3]，但是其机制尚不清楚。临床研究已经显示了针灸可通过调节氧化应激保护脑神经功能，但是其具体的作用机制尚不清楚[4-5]。核因子E2相关因子2(nuclear factor-E2-related factor 2， Nrf2)通路是机体调节氧化应激的重要通路，其可通过促进下游血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1， HO-1)发挥抗氧化作用，已经有研究显示上调Nrf2/HO-1通路可有效缓解脑出血引起的神经损伤[6]。本研究建立了TICH大鼠模型，通过银杏达莫和针灸共同干预7 d，发现其可通过促进Nrf2/HO-1通路减少脑神经元的凋亡，保护脑神经功能。现报告如下。

1 材料与方法

1.1主要实验材料 健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠(清洁级，240～280 g，南京医科大学动物实验中心)；AU640全自动生化分析仪(Olympus公司，日本)；银杏达莫注射液(贵州益佰制药，H52020031)；28号1寸毫针(环球针灸医疗器械，中国)；TUNEL凋亡试剂盒(碧云天公司，中国)；Nrf2和HO-1抗体和相关二抗(Abcam公司，美国)；PVDF膜(Bio-Rad公司，美国)；逆转录cDNA试剂盒和SYBR Green PCR Master Mix qPCR试剂盒(Roche公司，瑞士)。

1.2主要实验仪器 NM-G1型小动物核磁共振成像仪(纽迈科技公司，中国)；水迷宫视频跟踪分析系统(泰盟科技有限公司，中国)；倒置显微镜(Olympus IX71，Tokyo，日本)；ABI 7500 PCR检测系统(Life technology公司，美国)。

1.3分组、建模和干预方法 选择10只大鼠作为对照组，然后选择45只大鼠通过击打的方法建立TICH模型。首先通过腹腔注射戊巴比妥(剂量为2 ml/kg，浓度为20 g/L)麻醉大鼠，然后根据参考文献[7]通过击打建立TICH模型。大鼠俯卧固定在手术台，在额顶剃毛、消毒，人字缝和矢状缝右侧3 mm做2 cm的切口后钻直径为5 mm孔，在钻孔的过程中注意保持硬膜完整。然后将致伤垫片放置在孔上，以20 g砝码放在距头顶30 cm的高度行自由落体击打颅骨制备TICH模型。对照组大鼠仅钻孔。将建模成功大鼠随机分为TICH组、银杏达莫组和银杏达莫联合针灸组。在建模后24 h，银杏达莫组大鼠腹腔注射银杏达莫0.4 ml/kg，注射时间10 min，每日1次，连续注射5 d。对照组大鼠注射等量生理盐水。银杏达莫联合针灸组大鼠在银杏达莫组基础上进行针灸干预，根据参考文献，按照《实验动物穴位图谱》[8]找出百会穴和曲鬓穴，使用毫针透刺0.8寸，然后快速捻转(每分钟200转)，每次捻转5 min，停针30 min，每日1次，连续5 d，剔除期间死亡大鼠。

1.4建模结果评估 在建模后通过NM-G1型小动物核磁共振成像仪分析脑出血情况。然后在大鼠清醒后根据Longa评分[9]法对神经功能缺损进行评分，总分0～4分，分数越高提示缺损越严重。核磁共振成像发现明显出血并且Longa评分>2分的大鼠为TICH建模成功。

1.5水迷宫实验检测神经功能 在干预后(建模后第6天)使用水迷宫视频跟踪分析系统分析大鼠神经功能，根据参考文献[7]，通过检测大鼠的逃避潜伏期和穿越平台次数评估大鼠神经功能，其中逃避潜伏期越长、穿越平台次数越低提示神经功能损伤越严重。

1.6TUNEL染色检测脑组织神经细胞凋亡 根据试剂盒说明书进行操作，将脑出血周围脑组织固定并透化，然后将其放置于TUNEL溶液中，在37℃下孵育1 h。洗涤后加入Converter-POD溶液孵育30 min。之后依次进行显色、DAPI染色，然后进行封片。通过检测荧光反应计算凋亡率。

1.7RT-qPCR检测Nrf2和HO-1 mRNA水平 使用Trizol获得脑组织中总RNA并检测其浓度和纯度。使用逆转录cDNA试剂盒逆转录1 μg RNA用于合成cDNA(42℃下60 min，70℃下5 min，然后4℃保存)。使用SYBR Green PCR Master Mix和PCR检测系统进行qPCR实验(在95℃ 10 min，40个循环，94℃ 15 s，60℃ 1 min，60℃ 1 min，4℃保存)。比较循环阈值(ΔΔCt)用于分析RNA的表达。GAPDH用于标准化。

1.8Western Blotting检测Nrf2和HO-1蛋白水平 在液氮的保护下裂解脑组织，在12 000 r/min，4℃下离心15 min收集上清液，使用BCA方法确定蛋白浓度。SDS-PAGE(10%)电泳后进行PVDF膜转、封闭。加入一抗室温震荡2 h，后在4℃孵育过夜，加入二抗。使用GAPDH作为内参。

2 结果

2.1建模后脑出血情况 核磁共振检查结果显示，建模后TICH组、银杏达莫组和银杏达莫联合针灸组大鼠脑组织出现出血情况，提示击打的方法建立TICH模型成功。见图1。

图1 4组大鼠建模后脑出血情况TICH为创伤性脑出血

2.2神经缺损情况 大鼠清醒后行Longa评分结果显示4只建模失败，41只建模成功。然后随机选择39只，按照随机数字表法分为TICH组、银杏达莫组和银杏达莫联合针灸组，每组13只。随机选择10只检测Longa评分，结果显示3组Longa评分比较差异无统计学意义(P>0.05)。干预后TICH组大鼠1只死亡。干预后每组大鼠随机选择10只进行后续研究，结果显示银杏达莫组和银杏达莫联合针灸组Longa评分显著低于TICH组，并且银杏达莫联合针灸组低于银杏达莫组(P<0.05)。见表1。

表1 3组TICH大鼠Longa评分比较分)

2.3水迷宫实验结果 与对照组比较，TICH组的逃避潜伏期显著升高，而穿越平台次数显著降低(P<0.05)。银杏达莫组和银杏达莫联合针灸组的逃避潜伏期显著低于TICH组，而穿越平台次数显著高于TICH组，且银杏达莫联合针灸组的逃避潜伏期显著低于银杏达莫组，而穿越平台次数显著高于银杏达莫组(P<0.05)。见表2。

表2 4组大鼠逃避潜伏期和穿越平台次数

2.4脑组织神经细胞凋亡情况 对照组、TICH组、银杏达莫组、银杏达莫联合针灸组脑组织神经细胞凋亡率分别为(5.14±0.79)%、(36.54±4.97)%、(20.83±4.72)%、(12.48±1.45)%。与对照组比较，TICH组脑组织神经细胞凋亡率升高(P<0.05)。银杏达莫组和银杏达莫联合针灸组的脑组织神经细胞凋亡率低于TICH组，且银杏达莫联合针灸组低于银杏达莫组(P<0.05)。见图2。

图2 4组大鼠脑组织神经细胞凋亡情况(比例尺为50 μm)TICH为创伤性脑出血

2.5脑组织Nrf2和HO-1水平 与对照组比较，TICH组脑组织中Nrf2和HO-1 mRNA和蛋白相对表达水平显著升高(P<0.05)。银杏达莫组和银杏达莫联合针灸组的Nrf2和HO-1 mRNA和蛋白相对表达显著高于TICH组，且银杏达莫联合针灸组高于银杏达莫组(P<0.05)。见表3。

表3 4组大鼠脑组织Nrf2和HO-1 mRNA和蛋白相对表达水平比较

3 讨论

TICH是脑出血的一种，具有较高的致残率和病死率，虽然近年来关于治疗TICH的新方法和护理策略被应用于临床，TICH患者的神经功能损伤是影响预后和生活质量的重要因素。临床研究显示，急性脑出血患者神经功能的损伤可能与预后较差有关[10]，并且神经功能的变化可能直接影响预后[11]。因此对于TICH的临床治疗，除及时控制脑出血、清除脑血肿和脑水肿外，还应减轻患者的脑损伤。近年来多种干预方式被应用于脑出血后的神经功能恢复，包括亚低温、高压氧、脑保护药物等，但是其作用较有限，中医中药在治疗脑出血神经功能受损中表现出了较好的效果，本研究分析银杏达莫联合针灸治疗对TICH神经功能的保护作用。

银杏达莫是第四代银杏叶提取物，分析学研究显示其主要活性成分包括银杏内酯、银杏总黄酮、双嘧达莫等，在治疗脑出血、心肌细胞缺血再灌注损伤中均具有较好的效果[3,12]。银杏达莫在神经保护中的作用在临床上被广泛发现，一项回顾性研究发现银杏提取物对痴呆具有一定的治疗效果[13]。Mohamed和Abd El-Moneim[14]研究认为，银杏叶提取物可对氯化铝引起的大脑退行性改变有保护作用，并且这种作用可通过调节氧化应激和神经递质水平实现。针灸是祖国传统医学的重要组成部分，其可通过促进血液微循环、血液流变学、血流动力学、神经电生理等改善神经功能，并发挥改善神经痛、提高神经功能的作用[15-16]。本研究通过击打的方法建立TICH大鼠模型，并通过核磁共振验证了建模结果，然后分别通过银杏达莫和银杏达莫联合针灸干预，结果显示，建模后TICH组、银杏达莫组和银杏达莫联合针灸组Longa评分比较差异无统计学意义，干预后银杏达莫组和银杏达莫联合针灸组Longa评分低于TICH组，且银杏达莫联合针灸组低于银杏达莫组。此外，TUNEL实验也显示，与对照组比较，TICH组的脑组织神经细胞凋亡率显著升高，银杏达莫组和银杏达莫联合针灸组低于TICH组，且银杏达莫联合针灸组低于银杏达莫组。脑出血后会导致出血附近脑组织出现脑血肿和脑水肿，此部分区域的脑组织供血不足，而缺氧会引起氧化应激反应并引起神经元凋亡，从而导致神经功能的下降，而银杏达莫联合针灸可能通过恢复病灶脑组织的供血和调节氧化应激反应发挥对神经的保护作用。

为进一步分析银杏达莫联合针灸保护TICH神经功能的机制，我们检测了脑组织中Nrf2和HO-1 mRNA和蛋白的水平。Nrf2蛋白可促进抗氧化反应元件(antioxidant response element， ARE)的激活并促进HO-1的释放，从而发挥抗氧化作用[17]。在发生脑缺血/再灌注或脑出血初期，脑组织中的Nrf2通路会激活并发挥抗氧化作用，保护脑神经，但是随着时间的推移Nrf2通路的激活逐渐降低，HO-1的水平也下调，研究认为促进Nrf2/HO-1可能是治疗脑出血的新靶点[18-19]。本研究结果显示，干预后TICH组的大鼠脑组织中Nrf2和HO-1 mRNA和蛋白的水平显著高于对照组，银杏达莫组和银杏达莫联合针灸组高于TICH组，且银杏达莫联合针灸组高于银杏达莫组。临床研究已经发现了Nrf2/ARE在急性脑创伤中的保护作用，并且促进Nrf2通路可通过改善脑组织氧化应激水平保护脑神经功能[20-21]。此外，研究也发现了银杏内酯可保护氧葡萄糖剥夺/复氧引起的神经细胞损伤，并提高细胞活力，可作为脑缺血/再灌注的神经保护剂[22]。而氧化应激反应可直接或者通过炎性因子直接或间接引起细胞损伤和凋亡，从而保护脑神经功能[23]。此外，Wang等[24]研究发现，银杏叶提取物可通过调节p38 MAPK和NF-κB/IκBα通路调控凋亡相关蛋白Bcl-2/Bax的表达，从而发挥抗肝纤维化的作用。针灸具有调节局部微循环的作用，并且具有抗炎和抗氧化应激的功能，从而改善癫痫模型小鼠的神经功能[25]。此外，也有研究发现针灸可通过促进Nrf2-ARE信号通路改善帕金森小鼠模型的神经功能[26]。本研究中我们发现银杏达莫可通过促进Nrf2/HO-1通路改善氧化应激水平，而针灸也可通过促进微循环改善脑组织供氧，并进一步促进Nrf2/HO-1通路，银杏达莫和针灸协同调节氧化应激并减少脑神经元的凋亡，从而发挥保护TICH后脑神经功能的作用。

综上所述，银杏达莫可与针灸协同作用，促进脑组织中Nrf2/HO-1通路的表达，从而调节氧化应激反应，保护TICH大鼠的神经功能。但是关于银杏达莫中活性物质对Nrf2/HO-1通路的影响还需要进一步研究。