黑大蒜提取物对小鼠细胞免疫应答影响的初步探讨

冯永辉 王庆辉 王美茹 张 佩 王大南 吕昌龙 (中国医科大学免疫研究所,沈阳110001)

大蒜作为一种常见的植物,性温味辣,化学组成十分复杂,其含有的生物活性成分超过100种。它的药用价值主要在于其含硫化合物,其含量是洋葱、椰菜等高有机硫化合物蔬菜的4倍多[1]。人们在实验中发现大蒜具有降血脂、降血压、降血糖、抗肿瘤、抗菌、抗氧化和免疫调节等功效[2,3]。为此,近些年来人们不断开展对大蒜的研究,提取大蒜油、制备大蒜粉和合成大蒜素等,用于人类的健康保健,并进一步拓宽大蒜的用途。

近年来日本学者发现在控制湿度和温度的情况下,普通的白大蒜经过一定处理可由白色变成黑色(称为黑大蒜),黑大蒜无白大蒜原有的辣味,反而带有甜味,口感好,仍可直接食用。已有研究报道黑大蒜较白大蒜含有更多的氨基酸、有机硫和S-烯丙基-L-半胱氨酸(S-allyl-L-cysteine,SAC)[4],因此与白大蒜相比可能更具有应用前景。然而目前有关黑大蒜对机体免疫功能的影响国内外少见报道。为此,本实验应用黑大蒜提取物溶液,将其腹腔注射给小鼠,观察了黑大蒜提取物作为免疫调节剂的作用,为黑大蒜的实际应用提供理论和实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 40只BALB/c小鼠,6～8周龄,雌性,体重18～22克,购于中国科学院上海实验动物中心。

1.2 黑大蒜提取物溶液的制备及动物注射 黑大蒜粉由日本弘前大学佐佐木甚一教授提供。黑大蒜提取物按文献[4]的方法制备,用无菌生理盐水配制成1 mg/ml溶液。将动物随机分为8组,每组5只,1～7组为实验组,第8组为对照组。实验组小鼠每天腹腔注射0.1 ml的黑大蒜提取物溶液,对照组每天腹腔注射0.1 ml的生理盐水,连续注射5天。

1.3 主要试剂 RPMI1640(Thermo)、LDH底物(NBT购自Sigma公司、NAD购自中国科学院生物研究所、乳酸钠购自上海试剂三厂、PMS购自Fluka公司)、NP-40(Fluka公司)、Griess反应液 (Wako)、Trizol(Invitrogen)、RT-PCR kit(Takara)、IL-2、IL-4、IFN-γ和TNF-αELISA Kit(R&D)、RNA LA PCRTMKit(AMV)Ver.1.1(TaKaRa)、TRIzol(Invitrogen)黑大蒜提取物由日本弘前大学佐佐木甚一教授惠赠。

1.4 样品的采集 于末次注射后的第1～7天,从第1组小鼠开始,连续每天颈椎脱位处死1组小鼠,第8组小鼠于第7天处死。常规无菌取脾,制备脾细胞悬液,调整细胞浓度至1×107ml-1。一部分用于NK细胞杀伤活性的检测;另一部分细胞悬液接种于24孔板中,每个样品设3个复孔,每孔接种0.5ml,置5%CO2、37℃培养箱培养48小时,收集上清液用于NO、IL-2、IL-4、IFN-γ和TNF-α分泌水平的检测。

1.5 NK细胞活性的测定[5]

1.5.1 效应细胞的制备 将上述制备的脾细胞悬液作为效应细胞,浓度为 1×107ml-1。

1.5.2 靶细胞的制备 取10%FBS-RPMI1640培养液,传代培养YAC-1细胞,将传代后24小时的YAC-1细胞调整细胞浓度为1×105ml-1。

1.5.3 NK细胞活性的测定 取96孔细胞培养板,每孔加靶细胞悬液0.1 ml,实验组每孔加效应细胞悬液0.1ml,最大释放组每孔加1%NP-40于靶细胞中,自然释放组每孔加RPMI1640液0.1 ml代替效应细胞,置5%CO2、37℃培养箱培养2小时,每孔加0.05 ml细胞培养液,1 500 r/min离心10分钟,每孔取上清0.1 ml加LDH底物混合液0.1 ml作用20分钟后,每孔加入30μl终止液,最后用490 nm的滤光片测 OD值,并计算 NK活性。NK细胞活性(%)=

1.6 NO的检测(Griess法)[6]收集培养的脾细胞上清,与等体积的Griess试剂室温反应10分钟,检测小鼠脾细胞培养上清中NO-2含量。用NaNO2作为标准品,酶标仪检测570 nm处的OD值。

1.7 脾细胞上清中IL-2、IL-4、IFN-γ和 TNF-α水平的检测收集的实验组和对照组小鼠的脾细胞培养上清,采用ELISA 法检测上清中 IL-2、IL-4、IFN-γ和TNF-α的水平,具体方法严格按照说明书进行。

1.8 脾细胞FasLmRNA表达水平的检测 按照Trizol试剂盒说明书提取细胞总RNA,然后按照RNA LA PCRTMKit Ver.1.1说明将提取的总RNA反转录为cDNA。再以 cDNA为模板,PCR扩增FasL及βactin基因片段。FasL 引物:sense 5′-AAT TAC CCA TGTCCCCAGATC-3′,antisense5′-GCTGCTGTGGGC CCA TAT TG-3′;β -actin 引物:sense 5′-TCA GAA GGA CTC CTA TGT GG-3′,antisense 5′-TCT CTT TGA TGT CACGCA CG-3′;PCR循环参数:95℃变性1分钟,55℃退火1分钟,72℃延伸2分钟,共35个循环;扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳后,扫描分析。

2 结果

2.1 黑大蒜提取物对BALB/c小鼠NK细胞的杀伤活性的影响 在连续5天给予小鼠腹腔注射黑大蒜提取物后,比较实验组和对照组小鼠的NK细胞杀伤活性,结果显示:与对照组相(5.82%±1.38%)比,黑大蒜提取物处理4～6天后,实验组小鼠的NK细胞杀伤活性显著性升高,并在第 5天达到峰值(11.21%±1.17%),随后逐渐下降,结果见图1。

2.2 黑大蒜提取物对脾细胞培养上清中NO产生的影响 从黑大蒜提取物处理后的第3天到第7天,实验组小鼠NO-2始终处于较高的分泌水平,与对照组(11.58±0.86μmol/L)相比,均具有显著性差异(P＜0.001),结果见图2。

图1 黑大蒜提取物对小鼠NK细胞杀伤活性的影响Fig.1 The effect of black garlic extracts on thecytotoxicity of NK cells

图2 黑大蒜提取物对脾细胞培养上清NO分泌水平的影响Fig.2 The effect of black garlic extracts on the NO production in cultured supernatant of spleen cells

图3 黑大蒜提取物对脾细胞培养上清中Th1/Th2细胞因子的影响Fig.3 The effect of black garlic extracts on the Th1/Th2 cytokines'production in cultured supernatant of spleen cells

图4 脾细胞FasL mRNA表达水平的检测结果Fig.4 Thedetection results of FasL mRNA expression in spleen cells Note:M.Marker;1-7.Groups1-7;8.Control group.

表1 脾细胞FasL mRNA相对表达水平Tab.1 The relative expression level of FasL mRNA in spleen cells

2.3 黑大蒜提取物对脾细胞培养上清中Th1/Th2细胞因子的影响 在给予小鼠连续注射5天黑大蒜提取物后,实验组小鼠脾细胞培养上清中IL-2的分泌水平在处理后第 6天有显著升高,与对照组(20.14±3.88 pg/ml)相比,有显著的统计学意义(P＜0.05)。TNF-α的水平从处理后第1天就开始明显升高(P＜0.01),在第3天达到峰值(68.73±0.64 pg/ml),随后下降,但一直到第7天,均高于对照组(27.36±8.30 pg/ml)。IFN-γ的分泌水平在处理结束后也有显著升高,其中在第 3天达到峰值(105.05±55.73 pg/ml),随后下降,到第7天接近对照组水平。IL-4的分泌水平在处理后一直低于对照组(19.98±2.13 pg/ml),其中第3、4、5天的表达水平均显著低于对照组(P＜0.01),但是变化均在基线范围内,见图3。

2.4 脾细胞FasL mRNA表达水平的检测结果 通过半定量RT-PCR技术检测了小鼠脾细胞FasL mRNA的相对表达水平(图4)。给予小鼠腹腔注射黑大蒜提取物后,各实验组脾细胞FasL mRNA的表达水平与对照组相比均未见显著性差异(P＞0.05,表1)。这说明黑大蒜提取物刺激机体后,脾细胞FasL mRNA的表达并未出现有意义的增强。

3 讨论

近年来,有关大蒜功效的研究者越来越聚焦于大蒜的各种含硫化合物而不是大蒜素。含硫化合物可分为有气味脂溶性的(如diallyl-disulfide,DADS)和无气味水溶性的(如SAC)。水溶性的较脂溶性的效应功能更为稳定。Sasaki等[4]对黑大蒜的成分与普通大蒜的成分进行了对比分析,结果发现前者SAC的含量是后者的8倍。进一步研究结果还发现黑大蒜具有明显的抗氧化、抗肿瘤和抗菌作用。然而其作用机制尚不清楚,为此本论文从免疫学角度对黑大蒜的抗肿瘤和抗菌的机制进行了探讨。

NK细胞作为参与机体固有免疫应答的一类重要细胞,具有细胞毒性效应,能消除机体中的异常细胞,尤其是病毒感染或肿瘤突变的细胞。有流行病学数据表明大蒜的摄取量与胃肠道肿瘤的抑制性具有相关性[7]。我们的研究结果显示黑大蒜能通过增强NK细胞活性,提高对机体异常细胞的监视、清除功能。但脾细胞中FasL mRNA的表达水平未见明显变化,提示NK细胞杀伤活性的增强不是通过Fas/FasL杀伤途径而是可能通过其他途径来实现的。

NO作为一种非特异性免疫效应分子,在诱导瘤细胞凋亡、抗菌、抗病毒及胞内寄生虫中,发挥着重要的免疫防御作用。Pedraza-Chaverrí等[8]曾报道大蒜能促进体内NO合酶的合成,从而提高NO表达水平。参与机体免疫应答的另一种免疫调节因子——TNF-α,不仅能够直接抑制或杀伤肿瘤细胞,而且具有激活巨噬细胞和中性粒细胞功能以及促进T、B淋巴细胞增殖、分化等作用,促进单核巨噬细胞及其它细胞产生细胞因子 IL-1、IL-6、IL-8、IFN-γ以及TNF-α本身,发挥重要的免疫调节作用。以NO和TNF-α为代表的效应分子,对于机体发挥固有免疫具有重要的意义,本实验结果显示脾细胞上清中的NO和TNF-α分泌水平在黑大蒜提取物刺激小鼠之后均有提高,进一步表明黑大蒜对固有细胞免疫应答具有一定的刺激作用。巨噬细胞是体内这两种效应分子的主要来源,Cho等[9]人报道大蒜素能抑制腹腔巨噬细胞在缺少营养条件下的凋亡,因此,我们的实验结果也间接提示黑大蒜提取物对巨噬细胞的功能可能具有增强效应,其具体机制有待于进一步深入研究。在本实验中,以IL-2和IFN-γ为代表的Th1型细胞因子分泌水平明显增强,这与黑大蒜在机体抗肿瘤和抗感染的免疫效应密切相关,Ghazanfari等[10]发现大蒜能够诱导利氏曼原虫感染的小鼠体内产生高水平的IL-2和IFN-γ,但是降低IL-4和IL-10的表达水平。本实验中的IL-4分泌水平略有降低,其变化均在基础范围内,我们的结果表明黑大蒜提取物能诱导机体产生一种强有力的Th1型免疫应答。

本实验发现黑大蒜提取物能够显著增强NK细胞杀伤活性,提高NO水平,以及增强Th1细胞免疫应答,由此提示黑大蒜提取物能明显增强小鼠的细胞免疫应答,这为黑大蒜作为一种免疫调节剂在应用方面提供了有意义的实验依据。有关黑大蒜提取物的免疫调节作用是否优于普通的白大蒜有待进一步研究。

1 Garlic and Health Group.Collection of six papers.Medical and Aromatic Plant Science and Biotechnology[J].2007;1:1-36.

2 Koch H P,Lawson L D.Garlic:the science and therapeutic application of Allium sativum L and related species[M].Baltimore:Williams&Wilkins,1996:37-107.

3 Aviello G,Abenavoli L,Borrelli F et al.Garlic:empiricism or science[J].Nat Prod Commun,2009;4(12):1785-1796.

4 Sasaki J,Ch L U,Machiya E et al.Processed black Garlic(allium sativum)extracts enhance anti-tumor potency against mouse tumors[J].Med Aroma J Plant Sci Biotech,2007;1(2):278-281.

5 谢光麟.小鼠自然杀伤细胞在乌贼墨作用下的活性表达[J].中国医科大学学报,2002;31(1):23-24.

6 Cao Y M,Tsuboi T,Tori M.Nitric oxide inhibits the development of Plasmodium yoelii gametocytes into gametes[J].Parasitology International,1998;47(2):157-159.

7 Fleischauer A T,Poole C,Arab et al.Garlic consumption and cancer prevention:meta-analyses of colorectal and stomach cancers[J].Am J Clin Nutr,2000;72(4):1047-1052.

8 Pedraza-ChaverríJ,Tapia E,Medina-Campos O N et al.Garlic prevents hypertension induced by chronic inhibition of nitric oxide synthesis[J].Life Sci,1998;62(6):PL 71-PL 77.

9 Cho SJ,Rhee DK,Allicin PS et al.amajor component of garlic,inhibits apoptosis of macrophage in a depleted nutritional state[J].Nutrition,2006;22(11-12):1177-1184.

10 Ghazanfari T,Hassan ZM,Ebtekar M et al.Garlic Inducesa shift in cytokine pattern in leishmania major-infected BALB/c mice[J].Scand J Immunol,2000;52(5):491-495.