STAT3siRNA对肺腺癌A549细胞STAT3表达和细胞生物学行为的影响①

张 洁 罗麟洁 徐丽娜 房 洁 王鸿程 (泸州医学院附属医院呼吸科,泸州646000)

肺癌是当今世界上严重威胁人类健康与生命的恶性肿瘤之一。肺癌的发病机制还不十分明确,尚没有灵敏、特异的诊断方法和有效的治疗手段。美国著名肿瘤学家R.Peto预测如果我国吸烟和空气污染不即时控制,到2025年我国每年肺癌将超过100万,成为世界第一肺癌大国[1]。肺癌的发生与发展与癌基因的激活和抑癌基因的失活有关。STAT3是一种癌基因,有强烈的抑制细胞凋亡、促进细胞增殖的作用,参与了人类恶行肿瘤的发生、发展。它本身并不直接引起癌变,而是通过激活其靶基因产物的表达来影响肿瘤的发生,STAT3的下游靶基因都与细胞增殖、凋亡密切相关,如 Bcl-XL、B细胞淋巴瘤 /白血病基因-2(Bcl-2)、Mcl-1、细胞周期素 D1(Cyclin D1)、c-Myc、c-Jun、Fas、VEGF 等[2]。提示阻断STAT3信号转导通路可能起到有效的抗肿瘤作用。本课题组前期实验结果证实,肺腺癌组织中存在持续性激活的STAT3。本研究拟利用RNA干扰技术阻断STAT3激活,检测下游分子STAT3、CyclinD1、BAX、Bcl-2 、Caspase-9 的表达,观察其诱导肿瘤细胞产生、生长抑制和凋亡效应,了解STAT3作为肺癌治疗新分子靶点的可能性。

1 材料与方法

1.1 材料 人肺腺癌细胞株A549由四川大学华西医院呼吸科实验室提供;DMEM(高糖)培养基、胎牛血清为美国Gibco公司产品;Opti-MEMI为美国Invitrogen 公司产品 ;兔抗人 STAT3、Bcl-2、CyclinD1、BAX、Caspase-9多克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG抗体购自广东中杉公司。

1.2 siRNA的制备 根据siRNA的设计原则,设计三段STAT3特异shRNA基因序列,由广州锐博生物公司采用化学合成法合成三条双链siRNA,基因序列见表1。

1.3 细胞培养及基因转染 A549细胞用含10%小牛血清的DMEM培养基,于37℃、5%CO2环境下培养,分别转染三种siRNA,即siRNA1组(sihSTAT3-1组)、siRNA2组 (sihSTAT3-2组)、siRNA3组 (sih-STAT3-3组),并设阴性对照组(Non-Control-脂质体阴性对照组)、阳性对照组(sih GADPH组)、空白对照组(Non-Control-血清空白对照组)、荧光对照组(Non-Control-FAM荧光对照组)及各组相对应内参对照组 (β-actin组)。将细胞以1×104个/0.5 ml的密度接种到24孔培养板,37℃孵育培养1～2天,使每孔的细胞密度达到30%～50%。转染前1天,使用Opti-MEMI培养基(使细胞在转染时达到90%～95%的融合),分别用Opti-MEMI培养基稀释FAM-siRNA和Lipofectamine2000,FAM-siRNA按1.25μl/孔的浓度稀释,Lipofectamine2000按1μl/孔的浓度稀释,稀释好的Lipofectamine2000经室温孵育5分钟后与稀释好的FAM-siRNA轻轻混合,室温放置20分钟以形成FAM-siRNA-lipo2000复合物,将该混合物加入培养板中,轻晃混匀,在 37℃、5%CO2温箱孵育,4～6小时更换完全培养基。转染siRNA后16小时用荧光显微镜观察FAM荧光,并于转染后24、48、72小时收集其他各组细胞备用。

1.4 RT-PCR法检测A549细胞STAT3mRNA表达水平 转染后24小时收集细胞,按试剂盒说明分别提取各组细胞的RNA,逆转录合成相应cDNA,用Taq DNA聚合酶扩增STAT3。扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶进行电泳分析。依据目的基因PCR产物与β-actin基因PCR产物灰度比,判断靶基因的mRNA被siRNA沉默的程度。STAT 3-siRNAs对STAT 3mRNA表达的抑制率:抑制率(%)=(1-干扰组STAT 3mRNA相对含量/阴性对照组STAT3mRNA相对含量)×100%。PCR引物如下:STAT3 的上游引物 5′-GAGGAGGCATTCGGAAAG-3′,下游引物 5′-TCGTTGGTGTCACACAGAT-3′;β-actin 上游引物 5′-AACGGCTCCGGCATGTGCAA-3′,下游引物5′-CTTCTGACCCATGCCCACCA-3′;GAPDH 上游引物5′-TGGGTGTGAACCACGAGAA-3′,下游引物 5′-GGCATGGACTGTGGTCATGA-3′。

1.5 Western blot法检测A549细胞STAT3蛋白表达水平 转染STAT3siRNAs 48小时后收集细胞,提取细胞总蛋白,样品蛋白经SDS-PAGE电泳分离后电转移到PVDF膜上,经5%脱脂奶粉封闭过夜。加入兔抗人STAT3抗体,孵育 1.5～2小时。TBST洗膜,加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG抗体,孵育1小时,TBST洗膜。荧光显色,加入Lurriglo Keageut试剂A、B液,反应15～30分钟。X片曝光,拍照。

1.6 AM-BLUE法检测细胞增殖反应 转染STAT3siRNAs后收集细胞,分别加入AM-BLUE试剂,孵育2～6小时,收集细胞,制成密度为 1×104ml-1的细胞悬液,接种到96孔培养板中,分为干扰组 siRNA1 组 、siRNA2 组 、siRNA3 组 、阴性对照组 、阳性对照组、空白对照组 6组,每组6个复孔。在37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养 1天,待细胞贴壁,换为Opti-MEMI培养基培养1天,然后按siRNA 0.25μl/孔,Lipofectamine2000 0.25μl/孔的浓度进行转染。于转染后24、48、72小时分别向每孔加入10 μl AM-BLUE,在细胞箱孵育 2～6小时后,用酶联免疫检测仪进行检测,在570nm波长测定各孔吸光度,参考光波长 600 nm,实际的吸光度读数=OD570 nm-OD600 nm;并计算药物对细胞的抑制率。抑制率(%)=(空白对照组的OD值-干扰组的OD值)/空白对照组的OD值×100%。

表1 三段STAT3特异性siRNA序列Tab.1 Sequences of siRNA for STAT3 gene

1.7 流式细胞术(flow cytometer,FCM)检测细胞凋亡 转染STAT3siRNAs后48小时收集各组细胞,PBS洗涤重悬,调整细胞密度为(1×106～2×106)个/ml。加入Annexin-V-FITC和PI,避光室温反应后用流式细胞仪检测并分析结果计算凋亡率。

1.8 统计学分析 实验数据用SPSS10.0统计软件进行分析。测定值以±s表示,采用单因素方差分析和Person相关分析。P＜0.05有统计学意义,P＜0.01为显著差异。

2 结果

2.1 siRNA-STAT3转染效率检测 用脂质体2000转染siRNA-STAT3于A549细胞16小时后,用荧光显微镜观察,可见FAM分散在胞质中,说明转染成功,见图1。

2.2 转染siRNA-STAT3对A549细胞STAT3基因沉默效率 转染siRNA-STAT3 24小时后,可使A549细胞STAT3表达受到抑制,较阴性组和空白组A549细胞明显降低(见图2A),但其抑制率各不相同,siRNA1、siRNA2和siRNA3的抑制率分别为(85.8±1.4)%、(88.9±1.1)%和(86.8±0.9)%,其中 siRNA2作用最为明显(见图2B),因此,选择此序列作为目的序列进一步研究。

2.3 转染 siRNA-STAT3对A549细胞STAT3、CyclinD1、Bcl-2、BAX、Caspase-9蛋白表达的影响 干扰组与阴性对照组,干扰组与空白对照组STAT3、CyclinD1、Bcl-2、BAX、Caspase-9蛋白相对表达水平均有显著差异。其中干扰组STAT3、CyclinD1、Bcl-2蛋白相对表达水平较阴性对照组和空白对照组明显降低,差异具有统计学意义(P＜0.05),干扰组细胞中BAX、Caspase-9蛋白相对表达水平较阴性对照组和空白对照组明显升高,差异具有统计学意义(P＜0.05),但 STAT3、CyclinD1、Bcl-2、BAX、Caspase-9蛋白相对表达水平阴性对照组与空白对照组无显著差异(P＞0.05),β-actin表达量在各组之间无显著性差异(P＞0.05),见图3。

图1 荧光显微镜下观察转染效率(×200)Fig.1 Observed transfection efficiency under fluorescence microscope(×200)

图2 转染各组A549中STAT3 mRNA的表达Fig.2 STAT3 mRNA expression of cells in different group after siRNA transfection

图3 siRNA-STAT3转染后48小时 A549细胞蛋白表达Fig.3 Protein expression after siRNA transfection in the A549 cells

表2 STAT3基因表达对 A549细胞 CyclinD1、Bcl-2、BAX、Caspase-9表达影响的相关性Tab.2 The correlation between the expression of STAT3 and CyclinD1,Bcl-2,BAX and Caspase-9 in A549 cells

图4 转染siRNA-STAT3对A549细胞增殖的影响Fig.4 Effect of siRNA-STAT3 on proliferation of A549 cells

2.4 转染 siRNA-STAT3沉默STAT3基因表达对A549细胞 CyclinD1、Bcl-2、BAX、Caspase-9蛋白表达的相关性 siRNA2沉默A549细胞STAT3基因后,STAT3蛋白表达与CyclinD1蛋白表达及Bcl-2蛋白表达间呈正相关,具有统计学意义(P＜0.05),STAT3蛋白表达与Bcl-2蛋白表达呈负相关,具有统计学意义(P＜0.05)。STAT3蛋白表达与Caspase-9蛋白表达无相关性(P＞0.05),见表2。

2.5 转染siRNA-STAT3对A549细胞增殖的影响 细胞生长抑制率曲线图显示,STAT3基因沉默可以明显抑制A549细胞的生长,干扰组(siRNA1、siRNA2、siRNA3)分别在转染后24、48、72小时随着时间延长对细胞增殖的抑制率明显升高,差异有统计学意义(P＜0.05)。干扰各组与阴性对照组抑制率明显升高,差异有统计学意义(P＜0.05),见图4。

2.6 转染siRNA-STAT3对A549细胞凋亡的影响转染后48小时,siRNA1、siRNA2、siRNA3转染组,阴性对照组,空白对照组A549细胞凋亡率分别为(67.09±11.25)%,(70.61±14.46)%,(68.91±12.16)%,(26.64±11.81)%和(21.58±12.91)%,siRNAs组的凋亡率明显高于阴性对照组、空白对照组(P＜0.05)。

3 讨论

蛋白酪氨酸激酶(Jauns激酶,JAK)可使STAT磷酸化,并激活STAT蛋白,激活前的STAT蛋白属于胞浆蛋白,而活化后的STAT则以同源或异源二聚体形式移位到胞核,在靶基因的启动区与特定的DNA元件结合,发挥其生物学活性。我们前期研究中发现,STAT3蛋白在肺癌组织中有异常高表达,较正常组织显著增高[3]。STAT3是EGFR、IL-6/JAK、Src等多个致癌性酪氨酸激酶信号途径的汇聚点,因此,理论上讲,阻断肿瘤细胞STAT3信号传导通路就有可能起到治疗肿瘤的作用。王新华等[4]发现,应用小干扰RNA沉默人食管鳞癌细胞株STAT3基因,STAT3蛋白核结合活性下降,阻断了STAT3信号的持续激活,使细胞周期停滞于G0/G1期,细胞增殖受到明显抑制。Ren等[5]发现,在稳定表达STAT3的胶质瘤细胞中,干扰STAT3表达,可促进细胞凋亡。RNAi是一种序列特异的双链RNA分子。其在mRNA水平关闭相应序列基因的表达或使其沉默的过程,即siRNA介导识别并靶向切割同源性靶mRNA分子,从而实现基因敲除。siRNA研究中采用的方法有化学合成法、质粒或病毒载体法、体外转录法、长片段双链RNA切割法、PCR制备的siRNA表达框架体系等。本课题组曾成功构建了Psuper-siRNA-STAT3重组质粒,转染A549细胞可有效降低STAT3mRNA水平,最大干扰效率达85.32%[6]。本实验采用化学合成法得到siRNA,此种方法方便简单,易标记siRNA以追踪其在体内的活动状况,能够满足我们实验设计的需要。实验结果显示,siRNA沉默A549细胞STAT3基因表达后,STAT3siRNAs能在mRNA和蛋白质水平显著降低STAT3的表达,对STAT3蛋白表达的抑制率达73.8%,同时,CyclinD1、Bcl-2蛋白表达明显减少,BAX、Caspase-9蛋白表达显著增加;细胞增殖受到明显抑制,凋亡率显著增加。上述结果提示,用RNA干扰技术阻断STAT3的表达,可同时抑制多个癌基因的表达,对抑制肺癌细胞的生物学行为,抑制肿瘤生长起到协同作用,为抗STAT3基因治疗提供了实验和理论依据。同时提示,针对肺癌的靶向治疗时,单一靶向治疗效果如不满意,可同时联合多个靶向治疗。靶向治疗将成为治疗肺癌的新方向。

1 朱元珏,陈文彬.呼吸病学[M].北京:人民卫生出版社,2003:1011-1012.

2 Imada K,Leonard W.The Jak-STAT pathway[J].Mol Immunol,2000;37(1-2):1-11.

3 闫凌丽,王鸿程,朱 晨.STAT3信号转导途径在肺腺癌细胞中的表达活化[J].细胞与分子免疫学杂志,2009;25(2):141-142.

4 王新华,李珊珊,阎爱华 et al.小干扰RNA阻断信号转导子3信号对人食管鳞癌细胞株增值的抑制作用[J].中国病理学杂志,2007;36(6):379-383.

5 Ren W,Duan Y,Ji Y et al.Down-regulation of STAT3 induces apoptosis of human glioma cell:a potential method to treat brain cancer[J].Neurol Res,2008;30(3):297-301.

6 孙绍娟,王鸿程,许学亮 et al.RNA干扰技术沉默STAT3对人肺腺癌细胞生长抑制作用的研究[J].肿瘤防治研究,2007;34(8):565-567.