HPLC法同时测定加味白头翁汤凝胶灌肠剂中秦皮甲素和盐酸小檗碱的含量

蔡 乐，刘 萍，周 忻，张 娜(.解放军总医院药品保障中心中药房，北京市 00853;.天津中医药大学，天津市 30093)

溃疡性结肠炎是一种以反复发生结肠黏膜广泛性炎症、溃疡为主要特征的难治性消化系统疾病。该病病程长、治疗难度大、易复发、与结肠癌密切相关，被世界卫生组织定为现代难治病。近年来，随着我国人民生活方式的改变，溃疡性结肠炎的发病率呈逐渐增高趋势，据报道该病在我国的患病率已达 11.6/105人[1]。

白头翁汤为传统治痢名方，我院在此基础上增加药味制成凝胶灌肠剂用于溃疡性结肠炎的治疗，该方剂由秦皮、黄连、黄柏、白头翁、茜草、诃子和白及等组成[2]。本课题组前期曾采用高效毛细管电泳(HPCE)法测定制剂中秦皮甲素的含量[3]，为更好地进行质量控制，本研究建立了采用HPLC同时测定制剂中主要有效成分秦皮甲素和盐酸小檗碱的含量测定方法，为本品的质量标准制定提供依据。

1 仪器、药品与试药

1.1 仪器

Agilent 1200型高效液相色谱仪，包括1200系列四元梯度泵、自动进样器、二极管阵列检测器、化学工作站(美国 Agilent公司);Sartorius CP225D天平;PHS－2C pH计(上海虹益仪器仪表厂);KQ－2200DB型数控超声波清洗器(昆山超声仪器厂)。

1.2 试剂与药品

秦皮甲素对照品(中国药品生物制品检定所，批号:110740－200405);盐酸小檗碱对照品(中国药品生物制品检定所，批号:110713－2006009);乙腈、甲醇为色谱纯;磷酸二氢钾、三乙胺为分析纯;水为重蒸馏水。加味白头翁汤(药味为秦皮、黄连、黄柏、白头翁、茜草、仙鹤草、诃子、白及、紫草等，经解放军总医院刘萍主任药师鉴定)凝胶灌肠剂(批号分别为:0960101、090102和090103)以及缺秦皮和缺黄连、黄柏的阴性对照样品为自制。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱:Diamonsil C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流动相:溶液A为乙腈，溶液B为含5%三乙胺的0.33 mol·L－1磷酸二氢钾缓冲液(pH=3.0)，采用梯度洗脱的方法，0 ～9 min A∶B=12∶88，9 ～10 min A∶B=30∶70，10 ～22 min A∶B=30∶70;流速:1.0 mL·min－1;秦皮甲素和盐酸小檗碱的检测波长分别为334 nm和349 nm;柱温:30℃;进样量:10 μL。

2.2 对照品溶液的制备

2.2.1 秦皮甲素对照品溶液的制备:精密称取秦皮甲素对照品10 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇制成每1 mL含秦皮甲素1 mg的贮备液A，摇匀，即得。

2.2.2 盐酸小檗碱对照品溶液的制备:精密称取盐酸小檗碱对照品5 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇制成每1 mL含盐酸小檗碱0.5 mg的贮备液B，摇匀，即得。

2.2.3 混合对照品溶液的制备:分别精密移取800 μL贮备液A和200 μL贮备液B，置10 mL量瓶中，加甲醇制成每1 mL含秦皮甲素和盐酸小檗碱分别为80 μg和10 μg的混合溶液，摇匀，即得。

2.3 供试品溶液的制备

取加味白头翁汤凝胶灌肠剂约1.0 g，精密称定，置100 mL具塞锥形瓶中，精密移取25 mL甲醇，密塞，称定重量，超声提取15 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，0.45 μm微孔滤膜过滤，即得。

2.4 阴性对照试验

按处方组成比例及生产工艺分别制备不含秦皮和不含黄连、黄柏的阴性对照样品，按“2.3”项下方法制得2种阴性对照样品溶液。按上述色谱条件进行测定，测得对照品、样品、阴性样品色谱图，结果表明其他组分对秦皮甲素和盐酸小檗碱的测定无干扰，见图1。

2.5 线性关系考察

图1 HPLC色谱图Fig 1 HPLC chromatograms

精密吸取适量对照品溶液储备液A和B，加甲醇配制成含秦皮甲素和盐酸小檗碱浓度分别为4/1、20/5、40/10、100/25、200/50 μg·mL－1等5组标准系列溶液。分别精密吸取各浓度标准系列溶液10 μL，按上述色谱条件进行测定。以峰面积为纵坐标(Y)，标准系列溶液浓度为横坐标(X)绘制标准曲线，得秦皮甲素的回归方程为Y=13.848 X－2.844，r=0.999 7;盐酸小檗碱的回归方程为，Y=26.310 X－2.137，r=0.999 9。结果表明，秦皮甲素在 4～200 μg·mL－1范围内、盐酸小檗碱在1 ～50 μg·mL－1范围内线性关系良好。

2.6 精密度试验

取“2.2.3”项下混合对照品溶液，在上述色谱条件下，连续进样6次测定，计算秦皮甲素和盐酸小檗碱的峰面积RSD(n=6)分别为0.79%和0.81%，表明方法精密度良好。

2.7 重复性试验

取同一批号加味白头翁汤凝胶灌肠剂样品5份，分别按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下测定，计算秦皮甲素和盐酸小檗碱的峰面积RSD(n=5)分别为1.98%和1.54%，表明方法重复性良好。

2.8 稳定性试验

取同一样品溶液，在上述色谱条件下，分别于0、1、3、6、9和12 h进样测定，计算秦皮甲素和盐酸小檗碱的峰面积RSD分别为1.13%和0.94%，结果表明供试品溶液在12 h内是稳定的。

2.9 加样回收率试验

采用加样回收率法，分别取已知含量的同一批号(批号:090103)样品6份，精密称定，再精密加入一定量的秦皮甲素和盐酸小檗碱溶液，分别按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下测定秦皮甲素和盐酸小檗碱的含量，并计算加样回收率，结果见表1和表2。

表1 秦皮甲素的加样回收率试验结果(n=6)Tab 1 Results of recovery test of aesculin(n=6)

表2 盐酸小檗碱的加样回收率试验结果(n=6)Tab 2 Results of recovery test of berberine hydrochloride(n=6)

2.10 样品含量测定

取3批样品，在上述色谱条件下每批测定3次，计算秦皮甲素和盐酸小檗碱的含量，结果见表3。

表3 秦皮甲素和盐酸小檗碱的含量测定结果(n=3)Tab 3 Determination results of contents of aesculin and berberine hydrochloride(n=3)

3 讨论

由于秦皮甲素与盐酸小檗碱极性差异较大，本研究采用了梯度洗脱方法，使被测物质与杂峰分离良好，又缩短了分离时间。考察不同pH的流动相对被测物质分离的影响发现，随着流动相pH由2.5升高到4.0，盐酸小檗碱保留时间逐渐延长，而对秦皮甲素保留时间的影响不大，为在保证盐酸小檗碱分离度的基础上尽量缩短分离周期，最终确定的流动相pH为3.0。加入三乙胺对盐酸小檗碱峰形的改善影响很大，因此流动相中加入了三乙胺以减少盐酸小檗碱的拖尾。

对样品进行超声提取[4]和加热回流提取[5]的考察发现，这2种提取方法提取率相当，而超声提取方法相对简便且易于操作。通过考察超声时间长短实验，发现超声提取15 min时，样品提取已较为充分。此外，研究中发现，甲醇:HCL=100∶1的混合溶液提取[4]与甲醇提取相比，虽可提高盐酸小檗碱的提取率，但同时使杂质增多，干扰盐酸小檗碱的分离，因而采用甲醇作为提取溶剂。

[1]欧阳钦，Rakesh Tandon，KL Goh，等.亚太地区炎症性肠病处理共识意见(一)[J].胃肠病学，2006，11(4):233.

[2]刘 萍，陈利平.中西医结合治疗溃疡性结肠炎的临床研究[J].北京中医杂志，2003，22(4增):23.

[3]古 今，刘 萍.HPCE法测定治疗溃疡性结肠炎药物中秦皮甲素的含量[J].中国医院用药评价与分析，2009，9(4):287.

[4]张亚洲，骆莉莉，董立莎，等.RP－HPLC法测定抗妇炎泡腾栓中蛇床子素和盐酸小檗碱的含量[J].中国药房，2008，19(15):1 157.

[5]国家药典委员会编.中华人民共和国药典(一部)[S]. 北京:化学工业出版社，2005:59，191.