微生物限度检查薄膜过滤法供试液预处理方法探讨

2010-07-29苑思坤李玉芝王红云

中国药业 2010年18期

苑思坤，李玉芝，王红云

(河北省保定市药品检验所，河北保定 071000)

某些中药制剂具有较强的抑菌作用，需要采用薄膜过滤法对其进行微生物限度检查。在过滤过程中，供试品溶液中的不溶杂质常使0.45μm微孔滤膜阻塞，从而导致过滤速度极慢甚至不能过滤，极大地影响了检验的进行。如果前期能用某种滤材过滤掉供试液含有的大量极细粉及不溶性物质，则能极大地提高0.45μm滤膜的过滤速度，从而提高检验的效率和准确性。笔者考察了检验中常见的几种滤材，以确定其是否可用于供试液的过滤前处理。

1 环境与仪器、材料

环境为环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内。开放式薄膜过滤器(滤孔直径0.45μm);医用脱脂棉(定州市宝塔卫生材料有限公司、山东阳谷景阳岗卫生材料厂、邢台太行医用材料有限公司);医用脱脂纱布(定州市宝塔卫生材料有限公司);中速定性滤纸(杭州富阳特种纸业有限公司)。

实验菌株[1]为大肠埃希菌 Escherichia coli.[CMCC(B)44102]、金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus.[CMCC(B)26003]、枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis.[CMCC(B)63501]、白色念珠菌 Candida albicans.[CMCC(F)98001]、黑曲霉 Aspergillus niger[CMCC(F)98003]。

培养基包括营养琼脂培养基(批号为080925)，玫瑰红钠培养基(批号为080925)，营养肉汤培养基(批号为070111)，改良马丁培养基(批号为070105)。实验菌株及培养基均购自中国药品生物制品检定所。稀释液及冲洗液为pH=7.0的无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液。

2 方法与结果

2.1 菌液制备[2]

分别取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌，置营养肉汤新鲜培养液中培养18～24 h，白色念珠菌置改良马丁液体培养基新鲜培养液中培养18～24 h，用0.9%无菌氯化钠溶液洗脱黑曲霉孢子，按2005年版《中国药典(一部)》微生物限度检查法项下规定制备成50～100 CFU/mL的菌液。

2.2 滤材制备

取医用脱脂棉5 g，制成直径11 cm的均匀圆饼;取纱布折叠成32层，用剪刀剪成直径11 cm的圆饼;另取滤纸一片(直径11 cm)。将上述3种滤材在121℃下湿热灭菌。

2.3 菌液组回收率测定

以规定浓度的菌悬液作为对照菌液A，取1 mL，培养，计数;另将对照菌液A分别用不同滤材过滤，续滤液作为对照菌液B，取1 mL，培养，计数。平行做3次试验。回收率按下式计算:回收率=对照菌液B平均菌落数/对照菌液A平均菌落数×100%。结果见表1。可知，用医用脱脂棉、医用脱脂纱布过滤，回收率均接近100%，证明其对细菌、霉菌无拦截作用;采用滤纸过滤，几种菌回收率为20%～50%，可见其对细菌、霉菌有明显的拦截作用，不宜作为预处理用滤材。

表1 菌液组回收率测定结果(%)

2.4 样品组回收率测定

取规定浓度的菌悬液，加等量供试液作为试验菌液C，取1 mL，置开放式过滤器中，用1000 mL冲洗液冲洗(前期验证试验证明，该药的微生物限度检查可采用薄膜过滤法，冲洗量为1000 mL)，然后取出滤膜贴于制备好的平皿中，培养，计数;另将试验菌液C分别用棉花和纱布过滤，续滤液作为试验菌液D，取1 mL，同法培养，计数。平行做3次试验。回收率按下式计算:回收率=试验菌液D平均菌落数/试验菌液C平均菌落数×100%。结果见表2。可见，试验中样品组采用医用脱脂棉、医用脱脂纱布过滤，回收率均仍接近100%，证明其对细菌、霉菌无拦截作用;但试验中发现，医用脱脂纱布对极细粉和不溶性悬浮粒子的拦截作用较差，导致薄膜过滤困难，过滤时间甚至长达1 h，影响试验效率;而医用脱脂棉则能有效滤除样品溶液中的极细粉和悬浮物。因此，对于那些含不溶性杂质较多的供试品溶液，医用脱脂棉是一种很好的前处理滤材。

表2 样品组回收率测定结果(%)

2.5 医用脱脂棉考察

考察了3个厂家的脱脂棉产品。结果见表3。可见，不同厂家的医用脱脂棉，其菌液回收率无明显差异，对细菌均无拦截作用，均适用于微生物限度检查。另外，还考察了脱脂棉的用量(3，5，7 g)，结果用量为3 g时滤液较难通过薄膜过滤;用量为5 g和7 g时尚可，按2.3项下方法测定，回收率均无太大差异，但7 g圆饼吸附滤液较多，因此用量5 g最为合适。