高效液相色谱法测定牛黄上清片中连翘苷含量

谭志艺，刘永路

(广东省云浮市药品检验所，广东 云浮 527300)

牛黄上清片由人工牛黄、大黄、连翘、黄芩、当归等19味中药制成，具有清热泻火、散风止痛的功效，可用于治疗头痛眩晕、目赤耳鸣、口舌生疮、咽喉肿痛、大便燥结等[1]。该药原标准中无连翘苷含量测定项，为有效控制其质量，笔者采用高效液相色谱(HPLC)法测定方中连翘中连翘苷的含量，结果满意。

1 仪器与试药

Agilent 1200型高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)。连翘苷对照品(中国药品生物制品检定所，批号为110821－2007117);样品1(鹤壁市中药有限公司，批号为1004012);样品2(鹤壁市中药有限公司，批号为1004021);样品3(河南省百泉制药有限公司，批号为090312);乙腈(色谱纯)，水(超纯水)，其他试剂(分析纯)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件[2]

色谱柱:Diamonsil(钻石)C18柱(250 mm × 4.6 mm，5μm);流动相:乙腈－水(25 ∶75);检测波长:230 nm;流速:1.0 mL/min;柱温:30℃。理论板数按连翘苷峰计算达3500以上。

2.2 溶液制备

精密称取连翘苷对照品适量，置量瓶中，用甲醇溶解并制成40 μg/mL的溶液即得对照品溶液。取牛黄上清片20片，除去糖衣，称定总质量，研细，混匀，精密称取1.4 g，置具塞锥形瓶中，称定质量，精密加入甲醇25 mL，密塞，超声处理30 min，取出，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，滤液蒸干，残渣加水20 mL使溶解，用三氯甲烷振摇提取3次，每次20 mL，合并三氯甲烷液，回收至干，残渣用50%甲醇溶解，转移至5 mL量瓶中，加50%甲醇至刻度，滤过即得供试品溶液。按处方比例及工艺制备不含连翘的样品适量，按供试品溶液制备方法制成阴性对照品溶液。

2.3 方法学考察

阴性干扰试验:精密吸取对照品、供试品及阴性对照品溶液各10 μL，分别进样测定。结果阴性对照品溶液色谱图中在连翘苷峰相应的保留时间附近无干扰峰检出(图1)。

图1 高效液相色谱图

线性关系考察:精密吸取质量浓度为40 μg/mL的对照品溶液 1，2，5，8，15，25 μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。以峰面积 Y为纵坐标、连翘苷对照品进样量 X为横坐标绘制标准曲线，回归方程为 Y=71.307 X+0.1338，r=0.9999(n=6)。结果表明，连翘苷进样量在 0.08 ～1.00 μg 范围内与峰面积有良好的线性关系。

精密度试验:精密吸取对照品溶液10 μL，重复进样6次，记录色谱图。结果峰面积的 RSD=0.23%(n=6)，表明仪器精密度良好。

稳定性试验:精密吸取同一供试品溶液10 μL，分别在0，1，2，4，8，18，24 h 时测定峰面积。结果的 RSD 为 0.7%(n=7)，表明待测溶液至少在24 h内稳定。

重现性试验:取同一批号的样品6份，依法测定。结果的 RSD为0.54%(n=6)，说明方法的重现性良好。

加样回收试验:精密称取已知含量的样品6份，分别精密加入连翘苷对照品适量，依法测定其含量，求出加样回收率。结果见表1。

表1 连翘苷加样回收试验结果(n=6)

2.4 样品含量测定

精密吸取对照品及供试品各10 μL，分别注入高效液相色谱仪，记录峰面积，按外标法计算含量。结果样品1、样品2、样品3的连翘苷含量分别为 10.35，10.08，25.56 μg/片。

3 讨论

笔者考察了甲醇、70%乙醇溶液、50%甲醇溶液3种提取溶剂，230 nm和277 nm两种检测波长，乙腈－水(25∶75)、乙腈－水－冰醋酸(25∶75∶0.1)两种流动相。结果以甲醇溶液为提取溶剂、230 nm为检测波长、乙腈－水(25∶75)为流动相的效果较好，在此条件下色谱分离和线性关系良好，重现性及回收率结果均符合要求。

[1]WS3－B－1509－93，卫生部药品标准·中药成方制剂(第八册)[S].

[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[M].北京:化学工业出版社，2005:589.