火绒草抗急性炎症药效物质基础初步研究

姜 鸿， 侯 政， 邸子真， 王光函， 尤献民

(辽宁省中医药研究院，辽宁沈阳110034)

火绒草Leontopodium leontopodioides(Willd.)Beauv为菊科火绒草属植物的干燥全草。我国主要分布于东北、西北、华北及西南地区，青藏高原，在辽宁范 围内多生长于针叶、阔叶林交界处的低矮草丛中。火绒草味微苦，性寒;入肾、膀胱二经;具有清热凉血、消炎利肾的功效。其对流行性感冒，急、慢性肾炎，尿路感染，尿血，创伤出血等症状有一定的治疗作用。

本研究利用极性萃取法将火绒草提取液分离成不同极性化学成分群，对不同化学成分群进行抗急性炎症试验，将药效学实验结果与各提取物指纹图谱峰相对峰面积相关联，通过SPSS统计软件的相关分析初步确定火绒草药材与抗急性炎症作用相关的色谱峰，为火绒草药效物质基础的进一步深入研究奠定理论基础。

1 提取物制备

取火绒草药材，加水10倍量和8倍量分别提取2次，每次提取1 h，滤过，合并滤液，浓缩至体积与药材投料比约为1∶2时，放凉，量取1/2溶液，浓缩并减压干燥至干，称定重量，粉碎成细粉，加糊精稀释成1 g样品含10 g药材的粉末，作为1号提取物;剩余1/2溶液置分液漏斗中，分别用等倍量石油醚(30～60℃)、乙酸乙酯、水饱和正丁醇各萃取5次，分别合并各自萃取溶液，回收溶剂，减压干燥至干，称定重量，粉碎成细粉，分别加入糊精适量，配制成1 g样品含10 g药材的粉末:2号提取物(石油醚层)、3号提取物(乙酸乙酯层)、4号提取物(正丁醇层);取经过上述溶剂萃取后的水溶液，浓缩并减压干燥至干，称定重量，粉碎成细粉，加糊精适量，配制成1 g样品含10 g药材的粉末，作为5号提取物。

2 提取物指纹图谱分析

2.1 仪器与试药 Agilent 1100高效液相色谱分析仪:四元泵、在线脱气机、柱温箱、DAD检测器、全自动进样器(美国Agilent公司)。乙腈、磷酸为色谱纯;娃哈哈纯净水;其他试剂均为分析纯;火绒草药材采自于沈阳东陵祝家地区。

2.2 色谱条件 色谱柱:Kromasil C185 μ(200 mm×4.6 mm);流动相A:0.2%磷酸水溶液，B:乙腈;梯度洗脱。流速:1 mL/min;DAD检测器，检测波长:290 nm;柱温:25℃;谱图记录60 min。

2.3 供试品溶液制备 取1项下1～5号提取物各适量，分别精密称取2 g，加蒸馏水50 mL，称重，回流提取1 h，静置冷却至室温，称重，用蒸馏水补足减失重，摇匀，经0.45 μm滤膜滤过，分别取续滤液作为供试品溶液。

2.4 HPLC指纹图谱分析 取各供试品溶液，在上述色谱条件下进样，5个提取物以提取物1为准共得到36个色谱峰，见图1～图5，用X1～X36分别代表各色谱峰校正后的峰面积，见表1。

图1 提取物1指纹图谱

图2 提取物2指纹图谱

将原儿茶酸、原儿茶醛、绿原酸和咖啡酸混合对照溶液进样，记录色谱图，并将保留时间与样品各指纹峰比较，确认10号峰为原儿茶酸、13号峰为原儿茶醛、14号峰为绿原酸、16号峰为咖啡酸，见图6。

图3 提取物3指纹图谱

图4 提取物4指纹图谱

图5 提取物5指纹图谱

图6 照品溶液HPLC图

表1 火绒草提取物的峰面积

3 提取物对二甲苯致小鼠耳肿胀的抑制作用

选取72只昆明种小白鼠，随机分为6组，每组12只，分别为空白对照组，1、2、3、4、5号提取物组。各组动物按相应剂量灌胃给予相对应药液，给药容积均为20 mL/kg，空白对照组灌胃给予等量蒸馏水，连续给药7 d。末次给药30 min后，在小鼠右耳正反两面用微量加样器各滴加20 μl二甲苯致炎。20 min后各小鼠脱臼处死，剪下左右两耳，以9 mm打孔器打下两个耳片，电光天平称重，计算小鼠耳肿胀度和肿胀抑制率，肿胀度=右耳－左耳;肿胀抑制率=［(空白对照组肿胀度均值－用药组肿胀度均值)/空白对照组肿胀度均值］×100%。结果见表2。

由表2试验结果可见，与空白对照组比，3号提取物有极显著差异，1号提取物有显著差异，其余各提取物无显著性差异。

4 数据处理

4.1 数据统计 将指纹图谱化学数据(表1)和抗炎试验数据(表2)组成原始数据矩阵，自变量X1～X36代表各色谱峰校正后的峰面积，因变量Y代表药理指标-肿胀抑制率，组成矩阵，采用SPSS软件进行数据处理，采用相关分析的方法探讨火绒草药材中可能的药效物质基础。

表2 火绒草提取物对小鼠耳肿胀度的影响(n=10、±s)

表2 火绒草提取物对小鼠耳肿胀度的影响(n=10、±s)

注:与空白对照组比较，*P<0.05，**P<0.01(下同)。

/%空白对照组别 肿胀度/mg 肿胀抑制率7.74±1.36 2.647.95±1.12 -1号提取物 5.89±1.28* 25.912号提取物 7.82±1.23 1.643号提取物 5.39±1.53** 32.204号提取物 7.42±1.51 6.675号提取物

4.2 相关分析 相关分析(Correlate)是研究变量之间密切程度的一种统计方法。有双变量相关分析(Bivariate)、偏相关分析(Partial)等。当分析多个变量之间的关系，而这种关系又往往是变量之间的数量关系时，通常采用双变量相关分析方法。使用SPSS软件(13.0版)中的双变量相关分析可以得到变量两两之间的皮尔逊系数(Pearson Correlation Coefficients)及其统计量。表3列出的是双变量相关分析(Bivariate)方法处理所得的Pearson相关系数。

表3 36个色谱峰的相对峰面积与抑制率相关分析结果(皮尔逊系数)

与 Y 相关的变量有:X7、X13、X16、X30、X31、X35、X36;与 Y密切相关的变量有:X11、X14、X24、X28、X34。通过相关分析，这12个化学组分可能为火绒草抗急性炎症的药效物质基础。

4.3 回归分析 采用“有进有出”的回归分析方法，从一个自变量开始，视各个自变量X对因变量Y作用程度的显著，将显著变量逐个引入回归方程，而原引入的变量因后引入的新变量而变得不显著时，则将其剔除，每一步都进行F检验，以保证方程中只包含显著变量。这个过程反复进行直到再无新变量引入，也无变量被剔除，逐步回归完成，建立回归方程。共有X6、X15、X18、X36等20个变量被引入回归方程。

X6、X18化学组分与提取物对二甲苯致小鼠耳肿胀的抑制作用负相关，与药效预期的结果相反，因此被剔除。

X15、X36化学组分与肿胀的抑制作用正相关，可能为火绒草抗急性炎症的药效物质成分。在分析过程中同时发现有多重共线性情况，X36与 X7、X11、X13、X14、X16、X24、X27、X28、X30、X31、X34、X35等 12 个组分显著正相关，这 12 个化学组分也应是火绒草抗急性炎症的药效物质成分。因此经过回归分析，X7、X11、X13、X14、X15、X16、X24、X27、X28、X30、X31、X34、X35、X36等14个组分可能为火绒草抗急性炎症的药效物质基础。

5 讨论

中药药效物质基础是中药现代化的研究核心，以中药的主要功效和配伍理论为指导，采用恰当的药理模型评价药效，利用现代分离、分析技术筛选、提取、分离与药效密切相关的化学成分群，进而阐明化学成分与药理活性的关系，确定中药药效物质基础，是中药现代化基础研究的主要内容。

本研究将指纹图谱技术运用于其复杂成分的化学信息的采集，将化学信息与药理实验结果相关联，对其进行降维处理，得出与药效相关性比较大的少数组分作为药效物质基础，探索了中药药效物质基础研究的思路。综上所述，研究了中药火绒草的色谱指纹图谱和药效物质基础，从36个色谱峰中有效地抽提出14个变量初步确定为药效物质基础，对中药药效物质基础研究进行了有意义的探索，对中药复方药效物质基础研究也有一定的借鉴意义。

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