大鼠实验性结肠炎结肠黏蛋白分泌异常及马齿苋多糖干预研究

张 涛， 潘 峰， 陈建永， 王小平， 施 斌

(1.广州中医药大学，广东广州510405;2.杭州市红会医院，浙江杭州310003;3.江西中医药高等专科学校，江西临川344700;4.杭州市第一人民医院，浙江杭州310000)

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)是一种原因尚不明确、反复发作，肠道非特异性炎症性疾病。该病的发病机制尚不明确，但研究表明，黏蛋白的分泌和硫酸化的异常在UC的发生、发展中占据重要地位［1］。TNBs单剂灌肠诱导大鼠结肠炎模型，不需预先致敏动物或进行外科手术，而且损伤可以复制，具有简单易行，重现性好，与人类UC相似的特点，是UC发病机制研究及防治药物疗效评估的比较理想的实验动物模型［2］。本课题在中医药理论指导下，以公认有效的美沙拉嗪为阳性对照，观察马齿苋多糖缓解TNBs诱导大鼠结肠炎的实验研究。

1 材料与方法

1.1 实验材料 清洁级♂性SD大鼠48只，体重为(200±20)g，浙江中医药大学实验动物中心提供。美沙拉嗪(商品名惠迪，佳木斯鹿灵制药有限公司生产，批号H19980148)，5%2，4，6TNBs，购自 Sigma 公司(货号:P2297)。无水乙醇购自上海国药集团。HID-AB(高铁双胺-奥辛蓝)、AB-PAS(过碘夫酸-奥辛蓝)黏蛋白特殊染色试剂购自上海钰森生物试剂有限公司。

马齿苋多糖提取:称取粉碎的马齿苋干品粉末10 g，甲醇回流脱去表面脂肪，抽滤，药渣风干。再用80%乙醇回流除去小分子糖、苷类、生物碱等，药渣风干。然后分别取药渣5 g，以水作为溶剂对药渣进行多糖提取。水提液离心去除杂质，减压浓缩至小体积，加无水乙醇至浓度75%沉淀;静置24 h后过滤，用95%乙醇、无水乙醇、丙酮洗涤数次，真空干燥，得马齿苋多糖(polysaccharide of Portulaca oleracea，POP)，用蒽酮-硫酸比色法检测多糖含量为8.5%，60℃烘干备用。得率为10 g×8.5%=0.85 g。

1.2 方法

1.2.1 大鼠UC模型复制:所有SD大鼠称重后，按体重随机分4组，其中正常组12例，模型组12例，中药治疗组12例，西药对照组12例。除正常组外，其余36只SD大鼠先给予25%乌拉坦，按0.35 mL/100 g腹腔麻醉。参照Morris GP法改良［3］TNBs造模最佳剂量100 mg/kg计算，用1 mL注射器抽吸TNBs原液(0.18 mL/100 gSD大鼠)，继续抽吸0.25 mL的50%乙醇混合后，用聚丙烯管插入肛门上段8 cm后注入混合试剂，倒置夹肛2 h。6 h后观察造模动物，约75%大鼠出现稀便和血便。3 d后除正常组同步饲养外，模型组予0.33 mL生理盐水灌胃，中药治疗组予POP水溶液200 mg/0.33 mL灌胃，西药对照组予美沙拉嗪水溶液22 mg/0.33 mL灌胃，连续用药7 d［4］。各组治疗结束后处死动物。迅速剖取距肛8 cm远端结肠，置于10%中性甲醛液固定。

1.2.2 HE染色观察组织学损伤评分:将已用10%中性甲醛固定好的大鼠结肠取出，然后切取病变处，经用流水冲洗，放入生物脱水机进行逐级脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋切片4 μm，常规HE染色，封片，光镜下观察炎症和溃疡情况。评分标准参照文献［5］，具体见表1。

表1 UC光镜下结肠组织损伤评分标准

1.2.3 结肠黏蛋白特殊染色:采用HID-AB、AB-PAS法，具体步骤严格按试剂盒说明进行操作。

2 结果

2.1 结肠黏膜损伤情况和损伤评分比较 模型组肉眼可见结肠黏膜糜烂重，溃疡表浅多而且大;光镜下见黏膜严重充血、水肿，大量炎性细胞浸润，溃疡周围的腺体扩张，腺上皮细胞轻度增生。中药治疗组肉眼可见结肠黏膜糜烂程度减轻，溃疡小，黏膜充血;光镜下见愈合性小溃疡，黏膜及黏膜下层轻度充血、水肿，炎性细胞浸润。西药对照组肉眼可见结肠黏膜糜烂程度减轻，溃疡数量少，水肿程度较模型组轻浅;光镜下结肠壁黏膜面见愈合性小溃疡，肠壁各层充血、水肿，炎性细胞浸润，见表2。

表2 大鼠UC结肠组织损伤评分(±s)

表2 大鼠UC结肠组织损伤评分(±s)

注:经F检验，治疗组与模型组比较，△P<0.01;对照组与模型组比较，*P<0.01;治疗组与模型组对比，P>0.05。

组别 例数 肉眼损伤评分 光镜损伤评分正常组12 0 0模型组 12 7.36±0.27 4.45±0.20治疗组 12 2.46±0.15△ 3.12±0.12△对照组 12 2.58±0.10* 3.23±0.14*

2.2 结肠黏蛋白特殊染色结果 采用Image-pro PLUS 4.1版图像分析软件，每个样本随机选取3个高倍视野，采用灰度值120～145，计算阳性细胞数占总细胞数的百分比，对结肠黏膜黏蛋白的表达进行定量分析。模型组大鼠结肠黏蛋白分泌减少，治疗组大鼠结肠黏蛋白分泌增加，两组比较，有统计学意义(P<0.01)。见表3。

3 讨论

临床研究发现，以马齿苋为君药的中药复方清肠栓治疗溃疡性结肠炎疗效显著［6］。但马齿苋具体有效成分尚不明确，因而本研究在前期工作的基础上，开展马齿苋有效部位的研究。马齿苋为马齿苋科植物马齿苋(Portulaca oleracea L.)的干燥地上部分，首载于《神农本草经》。《本草纲目》记载:“其叶并比如马齿，而性滑利似苋，故名。”又名马齿草，春夏二季采收，除去残根及杂质，洗净，略蒸或烫后晒干。性味酸寒，归肝、大肠经。功效主治:清热解毒，凉血止血。《食疗本草》指出其能“煮粥止痢及疳痢”。POP为马齿苋提取物的有效成分，具有显著提高正常家兔淋巴细胞和PHA诱导的淋巴细胞的增殖能力，通过提高细胞免疫功能，从而调节机体的免疫功能［7］。本研究通过组织形态学评分发现模型组大鼠结肠溃疡较多而且表浅，结肠黏膜明显充血、水肿，大量炎性细胞浸润;治疗组予POP干预7 d后，镜下观察大鼠结肠未见明显溃疡，结肠黏膜轻度充血、水肿，少量炎性细胞浸润。治疗组与对照组疗效相似，表明POP具有明确缓解大鼠实验性结肠炎的效应。

表3 大鼠结肠黏蛋白特殊染色分析(±s)

表3 大鼠结肠黏蛋白特殊染色分析(±s)

注:经F检验，治疗组与模型组相比，*P<0.01;对照组与模型组比较，△P<0.01;治疗组与对照比较，P>0.05。

/%AB-PAS 0.16±0.03 0.06±0.03 0.12±0.01 0.13±0组别 正常组/% 模型组/% 治疗组/% 对照组.01 HID-AB 0.13±0.02 0.05±0.010.10±0.02* 0.11±0.01△

晚近研究提示，UC与黏蛋白合成、分泌异常密切相关［8］。结肠黏蛋白是一种由柱状上皮细胞和结肠杯状细胞分泌的糖蛋白，起保护结肠黏膜的作用;它由寡糖通过O-糖苷键与黏液蛋白骨架上的丝氨酸或苏氨酸残基结合而成的。黏蛋白在上皮细胞表面形成具有润滑作用并抵抗机械破坏及肠腔内有害物质侵袭的保护层。与胃、小肠的黏蛋白相比，结肠的黏蛋白硫酸化程度明显增高，硫酸化后的黏蛋白能抵制肠腔内细菌对黏液的酶解作用，从而更好地保护结肠黏膜，故在结肠中硫酸化后的黏蛋白更为重要，黏蛋白硫酸化程度的降低对结肠黏膜胶体层中的黏液是极其不利的［9］。

本实验结果发现，模型组大鼠结肠黏膜杯状细胞数目减少、杯状细胞中黏蛋白合成减少、黏液胶体层变薄、黏蛋白硫酸化的程度也降低，且黏蛋白减少量与局部炎症程度有关，炎症越严重，黏蛋白减少越明显;予POP干预7 d后，杯状细胞的数目及其黏蛋白分泌的表现均见明显恢复。这表明POP可能通过刺激结肠黏蛋白的合成及分泌，促进TNBs所致大鼠结肠炎损伤黏膜的修复和溃疡愈合。

［1］Amit-Romach E，Reifen R，Uni Z.Mucosal function in rat jejunum and ileum is altered by induction of colitis［J］.Int J Mol Med.2006，18(4):721-727.

［2］张 涛，谢建群.大鼠溃疡性结肠炎模型的实验研究［J］.中国中西医结合消化杂志.2006，14(4):240-242.

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［5］王 皓，欧阳钦，胡仁伟.三硝基苯磺酸结肠炎动物模型的建立［J］.胃肠病学，2001，6(1):7-10.

［6］谢建群，张 涛，施斌等.清肠栓治疗溃疡性结肠炎的临床和实验研究述评［J］.上海中医药大学学报.2008，22(1):70-72.

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［8］Sylvester PA，Wong NA，Myerscough N，et al.Mucin expression in the ileoanal reservoir reflects incomplete mucosal adaptation［J］.J Pathol.2002，197(1):28-36.

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