nPKC和cPKC调节骨骼肌葡萄糖转运体4型转位的研究*

李金茹 牛文彦 初桂兰

餐后升高的血糖80%由胰岛素刺激骨骼肌摄取，葡萄糖转运入细胞是骨骼肌葡萄糖代谢的限速步骤，由胰岛素敏感的葡萄糖转运体4型（glucose transporter 4,GLUT4）完成。基础状态下，GLUT4主要位于细胞内囊泡上，少量位于细胞膜上。胰岛素作用下，GLUT4从细胞内囊泡转位到细胞膜上，从而转运更多的葡萄糖进入细胞[1]。另一个生理性刺激GLUT4转位的因素是运动/肌肉收缩。相对于胰岛素作用机制而言，运动/肌肉收缩促进葡萄糖摄取的机制尚不明确。目前研究认为，收缩刺激骨骼肌葡萄糖摄取主要通过2个通路，一是腺苷酸激酶（AMPK）途径[2]，运动收缩消耗能量，AMP/ATP 升高，激活AMPK，促进骨骼肌葡萄糖转运；另一是Ca2+介导的信号，胞浆内Ca2+浓度升高触发肌肉收缩，激活下游信号分子。蛋白激酶C（PKC）为Ca2+的下游信号分子之一[3]。PKC可由二酰甘油（DAG）激活，肌肉收缩可增加细胞内DAG含量，激活PKC[4]。PKC在收缩刺激骨骼肌摄取葡萄糖的机制中的作用目前说法不一。本研究应用PKC激活剂佛波酯（PMA），观察激活PKC对GLUT4转位的调节作用。

1 材料与方法

1.1 试剂 PMA、PKC抑制剂Go6976、Go6983、邻苯二胺、抗myc多克隆抗体购自Sigma。DMEM高糖和低糖培养基购自天润善达（GIBCO分装）。胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）为以色列优级血清。马血清（horse serum，HS）购自美国GIBCO。细胞培养耗材购自Corning。

1.2 细胞培养与处理 稳定过表达GLUT4myc的C2C12小鼠骨骼肌细胞株由本课题组确立。C2C12GLUT4myc细胞用含 10%FBS (体积分数，V/V)和 5 mg/L杀稻瘟菌素（blasticidin）的DMEM高糖培养基，在37℃，5%CO2条件下培养，按4×104/mL接种于培养板中，待细胞汇合度达100%时，用含5%HS(V/V)DMEM高糖培养基分化细胞为肌管。C2C12GLUT4myc肌管用无血清的DMEM低糖培养基，在37℃，5%CO2条件下，培养3 h后进行实验处理。根据不同孵育细胞和条件分为PMA组（0.1 μmol/L PMA孵育20 min），Go6983+PMA 组（10 μmol/L Go6983 预孵育 30 min，10 μmol/L Go6983与0.1 μmol/L PMA 共孵育 20 min）、Go6976+PMA组（10 μmol/L Go6976 预孵育 30 min，10 μmol/L Go6976 与 0.1 μmol/L PMA 共 孵 育 20 min）、PMA24 h+PMA 组（1 μmol/L PMA预孵育24 h后，0.1 μmol/L PMA孵育 20 min）和PMA24 h+Go6976+PMA组（1 μmol/L PMA预孵育24 h后，10 μmol/L Go6976 预 孵 育 30 min，10 μmol/L Go6976 与 0.1 μmol/L PMA共孵育20 min），每组细胞均以Basal组（未处理）作为对照。

1.3 偶联抗体的吸光度分析法 处理后的C2C12GLUT4myc肌管经多聚甲醛固定，脱脂牛奶封闭后，用多克隆抗myc抗体室温孵育1 h；用偶联过氧化物酶HRP的山羊抗兔IgG室温孵育肌管1 h；加入底物邻苯二胺溶液，反应15~30 min后终止，用酶标仪测定上清液492 nm的吸光度值。

1.4 统计学方法 采用SPSS 13.0统计软件进行统计学分析。计量资料以x±s表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较方差齐时采用LSD-t检验，方差不齐时采用Dunnett’s检验,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PMA组、Go6983+PMA组及Go6976+PMA组C2C12GLUT4myc肌管GLUT4myc转位比较 PMA组与Basal组相比，GLUT4myc转位增加，差异有统计学意义（P<0.001）。Go6983+PMA组GLUT4myc转位比PMA组降低92%（P<0.01），与Basal组相比差异无统计学意义（P>0.05）。Go6976+PMA组GLUT4myc转位与PMA组相比降低，与Basal组和Go6983+PMA组相比增加，差异均有统计学意义（P<0.05），见表 1。

表1 PMA组、Go6983+PMA组、Go6976+PMA组GLUT4myc 转位 （n=4s）

表1 PMA组、Go6983+PMA组、Go6976+PMA组GLUT4myc 转位 （n=4s）

觹觹P ＜ 0．01

组别统计学处理P Basal组（1）PMA 组（2）Go6983＋PMA 组（3）Go6976＋PMA 组（4）F与Basal组吸光度值比值1.000±0.000 2.770±0.127 1.135±0.246 2.005±0.305 64.331**组比1∶2 1∶3 1∶4 2∶3 2∶4 3∶4<0.001 0.825 0.027 0.001 0.041 0.023

2.2 PMA组、PMA24 h+PMA组、PMA24 h+Go6976+PMA组C2C12GLUT4myc肌管GLUT4myc转位比较 PMA24 h+PMA组GLUT4myc转位比PMA组减少了74%（P<0.001）。PMA24 h+Go6976+PMA 组GLUT4myc转位与PMA组相比降低了89%（P<0.001），与Basal组相比差异无统计学意义（P>0.05），见表 2。

表2 PMA组、PMA 24 h+PMA组、PMA 24 h+Go6976+PMA 组 GLUT4myc转位 （n=4±s）

表2 PMA组、PMA 24 h+PMA组、PMA 24 h+Go6976+PMA 组 GLUT4myc转位 （n=4±s）

觹觹P ＜ 0．01

组别统计学处理P Basal组（1）PMA 组（2）PMA 24 h＋PMA（3）PMA 24 h＋Go6976＋PMA（4）F与Basal组吸光度值比值1.000±0.000 2.745±0.169 1.460±0.155 1.190±0.163 128.243**组比1∶2 1∶3 1∶4 2∶3 2∶4 3∶4 0.001 0.036 0.333<0.001<0.001 0.227

3 讨论

PKC是一种丝氨酸/苏氨酸激酶[5]。PKC家族有3种同工酶，cPKC、nPKC和非典型PKC。nPKC和cPKC可被DAG激活，cPKC还可被升高的Ca2+激活，而aPKC不受DAG和Ca2+的调节[6]。PKC抑制剂钙感光蛋白（Calphostin C）可以作用于nPKC和cPKC的DAG结合位点，抑制骨骼肌收缩刺激的葡萄糖转运[7]，推测nPKC或cPKC参与骨骼肌葡萄糖转运。

PMA作为DAG的类似物，是cPKC和nPKC的激活剂。PMA可以与nPKC和cPKC的DAG结合位点结合，从而激活PKC。PMA急性刺激可以增加骨骼肌葡萄糖转运[8]。本实验中，PMA急性刺激C2C12 GLUT4myc肌管（PMA组）的GLUT4myc转位，表明PMA激活nPKC和cPKC后，活化的PKC可以使GLUT4myc从肌浆转位到细胞膜，提示激活PKC（nPKC和cPKC）可调节骨骼肌GLUT4转位。

为了进一步确定nPKC和cPKC在骨骼肌GLUT4转位的信号转导中的作用，本实验应用了PKC抑制剂Go6983和Go6976。Go6983为nPKC和cPKC的抑制剂。Go6983+PMA组C2C12GLUT4myc肌管经Go6983预孵育后，可以完全抑制PMA急性刺激的GLUT4myc的转位，即Go6983抑制了nPKC和cPKC的激活，从而完全抑制了GLUT4myc的转位，说明cPKC和nPKC介导PMA急性刺激的GLUT4myc转位。Go6976为cPKC特异性抑制剂，Go6976+PMA组C2C12GLUT4myc肌管经Go6976预孵育可以部分抑制PMA急性刺激的GLUT4myc转位，即Go6976抑制了cPKC的激活，从而抑制了部分GLUT4myc转位，说明cPKC参与了C2C12 GLUT4myc肌管的 GLUT4转位的信号转导，与Go6983对GLUT4 myc转位的完全抑制相比，其未被Go6976抑制的GLUT4转位部分应为nPKC介导，表明nPKC同样参与了骨骼肌GLUT4转位的信号转导。

高浓度PMA慢性孵育可以下调PKC的表达，特别是在C2C12细胞中，主要下调nPKC（PKCε）的表达[9]。本实验中，PMA 24 h+PMA组C2C12GLUT 4myc肌管经高浓度PMA慢性预孵育后，再应用PMA急性刺激，GLUT4myc转位虽然较Basal组增加，但是幅度比PMA急性刺激的GLUT4myc的转位明显降低，推测是由于慢性孵育下调nPKC的表达，从而部分抑制PMA急性刺激的GLUT4myc转位，说明nPKC参与C2C12GLUT4myc肌管的GLUT 4myc的转位。而另一部分未受抑制的GLUT4myc转位可被cPKC抑制剂Go6976抑制，说明cPKC也参与了C2C12GLUT4myc肌管的GLUT4myc的转位。

综上所述，PMA可以与nPKC和cPKC的DAG结合位点结合，激活PKC，增强骨骼肌GLUT4转位。抑制nPKC或cPKC的活性，降低PMA刺激的骨骼肌GLUT4转位。因此，激活nPKC或cPKC可调节骨骼肌GLUT4转位。本课题组经初步实验发现，收缩刺激C2C12GLUT4myc肌管，可激活PKC,其是否介导收缩调节GLUT4转位的机制有待进一步研究。

[1] Karyowski O,Zeigerer A,Cohen,et al.GLUT4 is retained by an intracellular cycle of vesicle formation and fusion with endosomes[J].Mol Biol cell,2004,15（2）：870-882.

[2] Hayashi T,Hirshman MF,Kurth EJ,et al.Evidence for 5'AMP-activated protein kinase mediation of the effect of muscle contraction on glucose transport[J].Diabetes,1998,47（8）:1369-1373.

[3]Wright DC,Hucker KA,Holloszy JO,et al.Ca2+and AMPK both mediate stimulation of glucose transport by muscle contractions[J].Diabetes,2004,53（2）:330-335.

[4] Cleland PJ,Appleby GJ,Rattigan S,et al.Exercise-induced translocation of protein kinase C and production of diacylglycerol and phosphatidic acid in rat skeletal muscle in vivo.Relationship to changes in glucose transport[J].J Biol Chem,1989,264（30):17704-17711.

[5] Nishizuka Y.Intracellular signaling by hydrolysis of phospholipids and activation of protein kinase C[J].Science,1992,258(5082):607-614.

[6] Newton AC.Regulation of the ABCkinase by phosphorylation:protein kinase C as a paradigm[J].Biochem J,2003,370(Pt 2):361-371.

[7] Ihlemann J,Galbo H,Ploug T.Calphostin C is an inhibitor of contraction,but not insulin-stimulated glucose transport,in skeletal muscle[J].Acta Physiol Scand,1999,167（1）:69-75.

[8] Tsiani E,Bogdanovic E,Sorisky A,et al.Tyrosine phosphatase inhibitors,vanadate and pervanadate,stimulate glucose transport and GLUT translocation in muscle cells by a mechanism independent of phosphatidylinositol 3-kinase and protein kinase C [J].Diabetes,1998,47（11）:1676-1686.

[9]Cárdenas C,Müller M,Jaimovich E,et al.Depolarization of skeletal muscle cells induces phosphorylation of cAMP response element binding protein via calcium and protein kinase Calpha[J].J Biol Chem,2004,279（37）:39122-39130.