土著微生物原位修复石油污染土壤试验研究

陈立，万力，张发旺，何泽

1.中国地质大学（北京）水资源与环境学院，北京100083；2.中国地质科学院水文地质环境地质研究所，河北 石家庄 050061

我国西北黄土高原地区由于石油资源的大量开采利用，产生了许多环境问题，尤其是落地原油的污染已影响土壤的质量安全。土壤石油污染的防治研究工作已受到人们的重视，利用微生物修复石油污染土壤技术的开发与研究也受到国内外学者的广泛关注[1-6]。微生物修复技术主要机理是石油烃直接参与了微生物的生化反应，微生物利用石油烃作为生长所需的碳源和能源，并在酶的催化下将其水解成甘油、脂肪酸，最后降解为 H2O、CO2等代谢产物[7]。Jorgensen[8]的试验显示，经生物堆埋，被石油污染的土壤中石油可降低 71%。目前已知能降解石油中各种烃类的微生物共有约100余属200多种，它们分属于细菌、放线菌、霉菌、酵母以及藻类[9]。以往的报道多为室内实验研究，现场原位修复鲜有报道。本文选择陕北某油井旁污染土壤，利用放大培养的土著微生物菌剂，辅以物理和化学的方法，通过野外原位试验的方法，开展微生物修复石油污染土壤技术的试验研究，探索微生物修复技术在黄土区石油污染土壤修复的有效性、科学性、生态性，以期为当地的水土保持和生态环境保护提供技术支撑。

1 试验材料和方法

1.1 场地背景

场地位于陕西安塞西北约20 km某采油场内，黄土土壤，试验深度0～15 cm，土中含有少量2～10 mm的小砾石，土壤湿容重为1.821 g·cm-3；自然含水量为 9.18%；pH 为 8.4；NO3-质量分数为 55.3 mg·kg-1；NH4+质量分数为 8.85 mg·kg-1；石油质量分数为 1.3～4.6 mg·kg-1。

1.2 材料

1.2.1 化学试剂 MgSO4·7H2O、NH4NO3、CaCl2、FeCl3、KH2PO4、K2HPO4、KCl、盐酸、石油醚、三氯甲烷等，均为分析纯，主要由北京北化精细化学品公司和天津市四通化工厂生产，生化试剂主要从北京陆桥技术有限责任公司购置。

1.2.2 填加剂 谷糠黍糠、麦麸等

1.2.3 试验用水 为当地浅层潜水，pH为8.2，可溶性固体总量(TDS)为 420.5 mg·L-1；

1.2.4 试验所用的石油 为当地原油，油层深度为2400 m。

1.2.5 主要仪器 QZD-1型电磁振荡器、KQ218超声波清洗器、生物恒温箱、高速离心机、高压蒸汽灭菌器、无菌实验室、生化培养箱、752N紫外可见光光栅分光光度计、pHB-3型pH计、DDB-303A型电导率仪、电热干燥箱等。

1.3 方法

1.3.1 测试方法 石油、NO3-采用紫外分光光度法、NH4+采用纳氏试剂比色法、pH用pH计测试，TDS用电导率仪测试换算得出。

1.3.2 降解石油微生物细菌培养优选方法 土壤微生物细菌培养用《土壤微生物研究法》[10]和参考文献[11-13]介绍的方法，细菌初步鉴定用《常见细菌系统鉴定手册》[14]中的方法。

2 试验过程

2.1 菌种的分离与优选

用细菌的选择性培养基和富集培养基，对试验场石油污染土壤的样品进行菌种、菌群的培养分离，选择优化出试验用降解土壤石油的土著菌种、菌群。选择优化出的土著细菌经初步鉴定，主要为：假单胞菌属（Pseudomonas）、微球菌属（Micrococcus）、放线菌属（Actinomayces）、真菌类的青霉属（Penicillium）、曲霉属（Aspergillus）等菌群。

2.2 试验小区的设置和步骤

2.2.1 试验小区设置为 试验区 1、试验区 2、对照区、空白区。小区规格为：120 cm×120 cm，各小区相间20 cm，小区由西向东一字排列。

2.2.2 试验步骤

用当地取得的原油作碳源(污染物)，根据试验用接种量将选择优化出的各土著菌种、菌群进行放大培养，配成菌液制剂。将试验区、对照区和空白区的土壤进行人工反复翻耕，翻耕深度控制在 15 cm左右，其中的土块尽可能的打碎。在试验区1、试验区2和对照区土壤翻耕深度内均匀混入一定量的石油。在试验区1中按试验土壤质量的2.5%混入谷糠黍糠，在试验区2中按试验土壤质量的2.5%混入麦麸，作为添加剂；将一定量（占试验土壤质量的 3%）的土著菌液制剂用喷雾器均匀地接入试验区1和试验区2的土壤中，根据培养基成分比例加入氮、磷、钙、镁、硫、铁等调控营养元素，用当地地下水调节土壤水分质量分数至20%左右。对照区只加入一定量的石油，未加其它成分，作为自然降解。最后进行反复翻耕以便各种试验材料混合均匀，在试验区覆盖塑料薄膜便于保温、保湿、防雨。空白区不加任何物质作为监控样品。每次取样后，翻耕土壤层使其暴气充氧并补水，保持土壤水分质量分数在20%左右。

2.3 取样及测试

按一定时间间隔分别在各个区取样测试，每个区中以梅花状取5个不同点的同一深度土样，然后在盘子里混合均匀用4分法取样测试。试验完成后分别对各区试验层以下一定深度内分层取样。测试项目包括：石油烃总量、pH、土壤易溶盐、水分质量分数、NH4+质量分数、NO3-质量分数等，并同时监测地表及试验土壤温度。

3 结果与讨论

3.1 土壤中石油的去除率

在试验的0、3、7、11、16、21、26 d和32 d分别在试验区、对照区和空白区中取样测试，结果见表1和图1

从表1、图1中可见，试验区和对照区中0～7 d内，石油含量变化均很小，降解率均小于 8%且变化不大，说明试验区撒入的优势土著菌剂并没有发挥作用；同时，该现象也说明土著微生物本身对土壤中的石油污染物具有降解作用；两个试验区的降解率比对照区的降解率略高，这是因为试验区中加入的氮、磷、钙、镁、硫、铁等调控营养元素对土著微生物有激化的作用。

表1 各区土壤中石油质量分数随时间变化Table 1 Results of oil contents with time in the soil of experimental plots mg·kg-1

图1 试验过程中各区土壤中石油累计降解率随时间变化Fig.1 Cumulative degradation rate of oil with time in experimental plots through experimental process

7天以后两个试验区中的石油含量明显减少，对照区的含量变化不明显，这是因为试验区中加入的优势土著菌剂发挥作用，但该菌剂有延滞期（lag phase）。对比试验3 d和7 d的数据，可得菌剂的延滞期在3～7 d，然后进入对数期（logarithmic phase）。在试验的第11 d即对数期后d天，两个试验区的累计去除率就达到 69.52%以上，最大累计去除率达88.11%。对比两个试验区的数据和曲线趋势，说明所加入的谷糠黍糠、麦麸两种添加剂所起作用相差不大。

从对照区的试验数据看出，土著微生物本身对土壤中的石油污染物具有降解作用，本次试验累计去除率为20%左右，说明在自然条件下短时间内土壤中石油降解是比较低效且缓慢的。试验区1的16、21 d测试数据和对照区的16 d测试数据与大趋势略有差异，这可能是取样不均所致，也可能是黄土土壤各向异性的性质决定的。

空白区反映了在没有加任何物质情况下土壤中的石油含量，但在试验后期因试验区和对照区与空白区相邻且加之降雨和人为取样活动污染了该区，造成含量有所增加。

3.2 试验过程对下层土壤的影响

试验完成后，对两个试验区、对照区和空白区中不同土壤深度的pH，石油质量分数、水分质量分数、易溶盐质量分数、NH4+质量分数和NO3-的质量分数进行了测试，结果见表2。从pH、水分质量分数、易溶盐质量分数、NH4质量分数和NO3-的质量分数来看，可得试验区有别于对照区和空白区，说明氮、磷等易溶盐营养物质有一小部分随水而进入下部土层。从测试结果可见，试验层以下土壤石油含量增加很少，与对照区和空白区相比只是浅层略高，说明试验层土壤中石油没有向下扩散，或少量进入的营养物质激化了下部土层中的微生物降解了下渗的石油。

3.3 修复过程中对影响因素的调控

修复效果关键是优化的微生物和微地质环境（土壤环境因子）的相互结合、相互依存、相互作用和调控。调控因素主要有温度、水、氧气、营养元素、土壤环境因子的改善等等。试验过程中对以上因素进行了调控并跟踪测试，结果见表3、表4、表5。

3.3.1 土壤温度的调控

温度是影响微生物生长与存活的重要因素之一，过高或过低的温度都可抑制微生物生长。适度的温度可使细菌细胞中的生物化学反应速率加快。试验区强化的微生物菌群大多为中温微生物(13～45℃)，25～38 ℃为最适生长温度。

监测试验阶段地表的最高和最低温度结果显示，地表最高温度在25 ℃以上（在8月下旬至9月上旬），最低温度在20 ℃，昼夜温差大。如何调控温度，是试验效果好坏的关键。在两个试验区用塑料薄膜进行保温，使试验区土壤温度保持在25 ℃以上，但进入9月后因气温明显下降夜晚再用草帘覆盖。从表3可看到试验区土壤在试验层15 cm深，温度明显增加，比空白区增高5 ℃-8 ℃以上，尤其是在9月上旬以前增温保温效果显著。因此得出在该地区如若利用微生物生态修复技术的最佳时期应在每年的6月下旬至9月上旬，通过调控可使土壤温度保持在25 ℃以上。

表2 试验区2、对照区和空白区不同土壤剖面石油、pH、水分、易溶盐、NH4+、NO3-测试结果Table 2 The test results of oil content, pH, water content, TDS, NH4+ and NO3- with time in the soil of experimental plot 2, control plot and blank plot

表3 9月2日—20日试验区1与空白区土壤(5～15 cm) 8时与18时的温度Table 3 Temperature of soil (5～15cm) in experimental plot 1 and blank plot at 8:00 and 18:00 ℃

表4 试验区1、对照区和空白区土壤pH、水分质量分数随时间变化测试结果Table 4 The test results of soil pH and water content with time in the soil of experimental plot 1, control plot and blank plot

表5 试验区2、对照区和空白区土壤易溶盐、NH+、NO-43质量分数随时间变化测试结果Table 5 The test results of soil TDS, NH4+ and NO3-with time in the soil of experimental plot 2, control plot and blank plot

3.3.2 土壤pH、湿度分析

每一种微生物的生存都有一定的pH值范围和最适pH值。大多数细菌的最适pH值为6.5～7.5，放线菌pH值为7.5～8.0，真菌则可以在广泛的pH范围内生长发育。由表 4知试验区 pH值保持在7.6～8.4，这是定期补充一定量的磷酸盐缓冲剂的结果。表中所示pH多在8左右，这与大部分石油降解菌最适环境为偏碱性的性质相符。而空白区、对照区 pH值在 8.1～8.9比试验区略高一些。但在此pH值范围内对此次试验影响不大，试验区加入的磷酸盐主要是为微生物的生长增加营养元素。

水是微生物对石油污染物降解过程中的重要介质和氧的来源。前人研究表明，土壤湿度保持在20%以上对试验效果有利。因此，每次取样后在试验区加入15 L（约占试验土层的4%）的水。在表4数据显示试验层土壤水分质量分数保持稳定，这一含量基本保证了试验效果。空白区为天然变化的水分质量分数，对照区因取样后人为的翻耕可起到一定的保水作用，水分质量分数略高于空白区，并没有对土壤石油降解起到足够的作用，当然这仅是

3.3.3 易溶盐、NH4+、NO3-质量分数分析

营养元素可参与微生物细胞组成、构成酶的活性成分和物质运输系统以及提供生理活动所需能量。在试验期，微生物必定消耗大量的营养元素。因此，每次取样后补充一定量的N、P及S、K、Ca、Mg、Fe等微量元素调控营养物质。所加谷糠黍糠、麦麸作为添加剂补充其它生物素和营养盐。表5为试验区2、对照区和空白区中易溶盐、NH4+、NO3-质量分数随试验过程的变化，从中可见试验区于8月21日补充了各种营养元素，反映出随试验进程微生物活动将石油和各类元素利用、降解、转化的过程。表中8月23日至30日土壤含盐量是增高的，显示出添加剂的矿化为土壤增加了易溶盐类元素，该过程验证了本次试验添加的营养元素是比较适度。对照区、空白区则反映了自然条件下的变化，降雨使其质量分数降低。

3.3.4 土壤中氧的调控

环境条件的调控包括氧气的供给，供氧量的多少能影响微生物细胞内许多酶的活性和细胞的呼吸作用，控制着微生物的生长和对有机物的降解能力，影响着微生物对污染石油的降解速度。本试验主要从四个方面对土壤氧的供给进行了调控，试验前及每次取样后均要翻耕试验层，使其充分与大气混合；其次是土壤具有一定的水分，水中提供的氧；另外添加剂的投加，它不仅为土壤补充营养，而且增大了土壤的蓬松性和通透性。另外，加入 NO3-不仅增加氮源也增加了氧的来源渠道。原因之一。

4 结论

试验对陕北某油田的石油污染土壤的样品进行菌种、菌群分离、选择，最终确定假单胞菌属（Pseudomonas）、微球菌属（Micrococcus）、放线菌属（Actinomayces）、真菌类的青霉属（Penicillium）、曲霉属（Aspergillus）等菌群。对这些菌群进行放大培养，进行油污土壤修复试验研究。两个试验区土壤中人为添加石油质量分数分别为1542、1886 mg·kg-1时，经过11～32 d土著微生物原位修复，土壤中的石油累计降解率可达69.52%～88.11%，而对照区土壤中人为添加的石油含量变化不大，累计去除率在20%左右，说明在自然条件下土壤中石油降解是缓慢的。谷糠黍糠、麦麸两种添加剂对优化菌液的修复效果的作用基本相同。试验说明试验层土壤中石油没有向下部涂层扩散，或少量进入的营养物质激化了下部土层中的微生物，从而降解了下渗的石油。试验过程中对土壤温度、水分、氧和营养物质等影响因素进行了调控，起到了良好的作用。

本试验验证了土著微生物原位修复技术在现场修复石油污染土壤的试验效果是显著的，方法是可行的。

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