旋覆代赭汤对混合性反流性食管炎模型大鼠CyclinD1表达的影响*

杨幼新，袁红霞，马 艳，韩顺平，魏爱勤，潘 淼，徐军娟

（1.天津中医药大学国际教育学院，天津 300193；2.天津中医药大学，天津 300193；3.天津市南开区中医医院，天津 300123）

反流性食管炎（RE）是由胃及十二指肠内容物返流至食管所引起的食管黏膜的炎症、糜烂及溃疡等病变，是消化系统的常见病、多发病，严重影响人们的生活质量，且可引起多种并发症。西医对RE的治疗是以抑酸为主，对胆汁和混合反流引起的食管黏膜损伤效果较差。笔者临床中运用旋覆代赭汤加减治疗混合性反流性食管炎，收到较好的临床疗效。为探讨其作用机制，实验观察了旋覆代赭汤对混合性反流性食管炎大鼠的细胞周期蛋白D1（CyclinD1）的表达，现报道如下。

1 实验材料

1.1 实验动物 健康清洁级Wistar大鼠80只，雌雄各半，体质量（200±20）g，由卫生部生物制品检定所动物中心提供。

1.2 实验药品 旋覆代赭汤（旋覆花15 g，代赭石5 g，半夏 15 g，生晒参 10 g，炙甘草 15 g，生姜 20 g，大枣20 g），制成含生药浓度为1 kg/L的水煎剂，分装，置4℃冰箱备用。枸橼酸莫沙必利分散片，成都大西南制药股份有限公司产品，用蒸馏水配制成0.15 g/L的混悬液，分装，置4℃冰箱备用。

1.3 实验试剂 抗鼠CyclinD1单克隆抗体（克隆号：72-13G），为武汉博士德公司产品，SP系列检测试剂盒及3，3-二氨基联苯胺（DAB）显色试剂盒，为美国ZYMED公司产品。

2 实验方法

2.1 分组及造模 将80只健康Wistar大鼠适应性喂养7 d后，随机分为4组，即正常对照组、模型组、中药治疗组、西药对照组，每组20只。除正常对照组外，其余各组参照王雯[1]等造模方法，通过改良的Clark[2]方法行“食管十二指肠端侧吻合术”。手术方法为先予10%水合氯醛（3 mL/kg腹腔注射）麻醉大鼠，然后常规备皮并消毒后以上腹部正中切口进腹。进腹后将食管下段分离出神经和血管，结扎贲门，用动脉夹夹闭食管上段，然后切断食管，缝合贲门并荷包包埋入胃中，保留全胃，距幽门口约2 cm处用4号手术缝线轻轻结扎十二指肠，然后在距幽门口约1 cm处纵行剪开十二指肠壁约0.5 cm，然后与食管下端全层间断吻合4～6针，吻合完毕后，用注射器抽吸0.5 mL生理盐水，分别从吻合口的食管端和十二指肠端向吻合口方向缓慢推注生理盐水，观察吻合口是否通畅或有无漏液，检查完毕后腹腔内注入硫酸庆大霉素2万IU关腹。术后予10%葡萄糖盐水自由饮水，禁食48 h，此后常规喂养。术后1周，每日以10万IU/kg体质量腹腔注射硫酸庆大霉素注射液。

2.2 给药方法 于造模术后第7天开始，正常对照组、模型组以6.25 g/kg给予0.9%生理盐水灌胃，中药治疗组以6.25 g/kg给予体质量给予旋覆代赭汤水煎剂灌胃，西药对照组以1.56 mg/kg给予莫沙必利混悬液，共给予21 d。

2.3 检测方法

2.3.1 食管黏膜组织形态学检测 自吻合口向咽喉部截取2cm左右食管，纵行剖开，生理盐水清洗，10%甲醛固定，石蜡包埋，常规苏木-伊红（HE）染色，光镜观察组织形态学变化。

2.3.2 免疫组化法检测CyclinD1的表达 石蜡切片脱蜡，微波炉90～100℃抗原修复，3%过氧化氢灭活内源性过氧化酶活性，10%山羊血清封闭，滴加适当比例稀释的一抗、二抗及适当比例的辣根酶标记链酶卵白素，DAB显色，观察CyclinD1的表达。

2.4 统计方法 采用SPSS 11.5统计软件包对数据进行统计分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，偏态分布资料的多组间比较使用秩和检验，多组间阳性率的比较采用χ2检验。

3 结果

3.1 结果判定标准

3.1.1 组织形态学结果判定标准 食管黏膜组织形态学观察采用中华医学会消化内镜分会2004年12月颁布的RE诊断标准[3]，见表1。

表1 反流性食管炎黏膜病理分级Tab.1 Pathological grade of esopageal mucosa in reflux esophagitis

3.1.2 CyclinD1染色结果判定标准 以胞核内见呈棕黄色或黄褐色颗粒，判为阳性染色细胞。每张切片随机选取5个高倍视野,光镜下按阳性染色的细胞数分级。（-）：无阳性细胞或阳性细胞数＜10%。（+）：阳性细胞数≥10%而＜25%。（++）：阳性细胞数≥25%而＜50%。（+++）：阳性细胞数≥50%。

3.2 组织形态学观察结果 正常对照组镜下可见黏膜层表面为非角化复层鳞状上皮，其基底细胞层中有少许黑色素母细胞和内分泌细胞。模型组可见鳞状上皮细胞水肿，基底层细胞增生，鳞状上皮的黏膜固有层乳头伸长，上延至上皮表层下，固有层水肿，可见较多嗜中性粒细胞浸润，部分可见黏膜糜烂或溃疡形成，以上改变以食管下段为重。中药治疗组鳞状上皮未见明显细胞病变，黏膜较完整，未见糜烂、溃疡等病变，固有膜菲薄，黏膜间质仅见少许淋巴细胞及单核细胞浸润。西药对照组鳞状上皮细胞略水肿，黏膜尚完整，未见明显糜烂、溃疡等病变，固有膜乳头缩短，固有膜内可见少许慢性炎细胞浸润。各组大鼠食管黏膜病理分级及积分情况。见表2。

表2 各组大鼠食管黏膜病理分级及积分Tab.2 Pathological grade and integral of each group rats with esophageal mucosa

3.3 CyclinD1的阳性率表达情况 正常对照组大鼠食管黏膜的上皮基底层细胞可见部分细胞阳性染色。模型组表达较强，而且更浅层上皮细胞亦有阳性染色；中药治疗组及西药对照组表达较模型组降低，阳性的细胞主要分布于基底细胞层，中药治疗组降低更为明显。4组之间CyclinD1阳性染色的细胞数分级比较，差异有显著性。4组之间CyclinD1阳性率比较，模型组最高，正常对照组最低，两者比较差异有显著性。中药治疗组阳性率显著降低，与模型组相比差异有显著性，与正常对照组及西药对照组相比差异无显著性。西药对照组阳性率亦较模型组有所降低，但差异无显著性。由此可见旋覆代赭汤可明显降低混合性反流性食管炎食管黏膜CyclinD1的表达，从而起到治疗混合性反流性食管炎、预防复发及癌变的作用。见表3。

4 讨论

中医学无“反流性食管炎”这一病名，根据其症状表现可归属于中医学中的吐酸、吞酸、反胃、嘈杂、呕吐、噎膈等范畴。其病位主要在食管，属脾络胃，联系肝胆，上可及咽喉，下连及脘腹。笔者根据多年临床经验认为“脾胃虚弱，痰阻气逆”为RE的基本病机。脾主运化水湿，脾胃为气机升降之枢纽，饮食失调、劳倦过度或情志不畅皆可损伤脾胃，脾胃气虚，一则运化水湿不利，蕴湿生痰，壅滞脾胃；二则气机升降失和，涩滞逆乱，夹痰上冲；或脾胃本虚，湿热中阻，肝气横逆，胃失和降，浊气上逆，痰气郁阻；或忧思恼怒，五志过极，肝失疏泄，横逆犯胃，致使脾胃之气受损，升降失常，运化失职，滋生痰浊，并随虚气上逆，出现反酸、烧心、呕恶、吞酸、嘈杂、嗳气等症。并且本病治疗中易复发的重要原因就是重标轻本，故益气和胃治本要贯穿始终。

表3 各组大鼠食管黏膜CyclinD1的表达情况Tab.3 The expression of Cyclin D1 in esophageal mucosa in each group rats

旋覆代赭汤出自《伤寒论·辨太阳病脉证并治下》第161条“伤寒发汗，若吐若下，解后心下痞硬，噫气不除者，旋覆代赭汤主之”，全方由旋覆花、代赭石、半夏、生姜、人参、炙甘草、大枣7味药组成，主治外邪虽经汗、吐、下而解，但治不如法，中气已伤，痰涎内生，胃失和降，虚气上逆以致心下痞硬，噫气不除之证。后世医家对此方的应用发挥甚广，各种病证中虽不见伤寒之表里证，亦未经汗、吐、下治之，但见心下痞闷、胀痛、噫气、嗳气、反胃、呕吐、呃逆等证，辨证属脾胃虚弱，痰湿内生，痰阻气逆，升降失常所致者，据“有是证用是药”之法，多采用此经方治疗，疗效显著。

CyclinD1是一种在细胞周期中含量呈周期性变化的重要细胞周期调节蛋白，能启动细胞周期并促进细胞DNA的复制过程，有强烈的促细胞增殖作用，CyclinD1 从正常食管→RE→Barrett’s食管（BE）→食管腺癌（EA）的表达程度逐渐增强，与RE、BE及EA相关[4]。本实验结果表明，旋覆代赭汤可明显降低CyclinD1在食管黏膜中的表达，从而抑制食管黏膜上皮的过度增殖，起到治疗RE、预防癌变的作用。RE在组织学水平治愈后，食管上皮细胞内CyclinD1水平未完全恢复正常可能是其易复发的原因之一，而旋覆代赭汤可较好地使CyclinD1水平恢复至接近正常水平，可能是它预防RE复发及癌变的原因之一。

[1] 王 雯，李兆申，许国铭，等.不同方式建成3种反流性食管炎模型[J].解放军医学杂志，2000，25（3）：171－173.

[2] Clark GRB,Smyrk TC,Mirvish SS,et al.Effect of gastroduodenal juice anddietary fat on the development of Barrett's esophagus and esophageal neoplasia:An experimental rat model[J].Ann Surg Onco1,1994,1:252-254.

[3] 中华医学会消化内镜学分会.反流性食管炎诊断及治疗指南[J].中华消化内镜杂志,2004,21(4):221-222.

[4] 汪 涛，龚 均.大鼠混合反流模型中COX-2、PCNA、Cyclin D1的表达[J].西安交通大学学报（医学版），2005，26（5）：460－462.