补肾调肝法对治疗自身免疫性卵巢早衰小鼠的实验研究*

蔡品均，金 哲，黄文玲，李 玲，林佳静

（1.北京中医药大学研究生，北京 100029；2.北京中医药大学东方医院，北京 100078）

卵巢早衰（POF）通常是指女性40岁之前闭经，伴随持续的卵泡刺激素水平升高和雌激素水平下降。在人群中发生率为1%～3%，在继发性闭经者中2%～10%[1]。继发性闭经是POF的主要临床表现，POF前月经改变的形式不一，约有50%患者会有月经稀发或不规则子宫出血；50%患者突然出现闭经。POF患者会像绝经妇女那样出现雌激素低下征候群，如潮热、出汗、抑郁、失眠、记忆力减退、外阴瘙痒、阴道灼烧、尿频、排尿困难等症状。

实验参照文献研究[2]制作免疫性小鼠卵巢早衰模型。随机分6组。造模成功后第6天开始各药物组灌胃给药，分别给与补肾调肝中药及雌激素（戊酸雌二醇），模型组及空白组灌胃同量的0.5%的羧甲基纤维素钠（CMC）。连续灌胃4周。检测生殖内分泌指标及卵巢形态改变，旨在探讨补肾调肝法对卵巢早衰的治疗作用，为指导临床提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 SPF级BALB/C小鼠120只，雌性，7～9周龄。购于北京维通利华实验动物技术有限公司，动物合格证号：SCXK（京）2002-0003，体质量28～30 g，代谢笼中饲养，23～25 ℃室温，光照 12 h，食水随意。观察1周后，随机分为6组，每组10只。1.1.2 药物及试剂

1.1.2.1 中药配置 乌萸汤组方（山茱萸、乌药等）饮片一次性从同仁堂购入，按国家相关要求经鉴定后确为为正品，由北京中医药大学东直门医院制剂室按常规方法进行煎煮、浓缩，一次性煎出，按照所需配成高、中、低浓度药液，浓度分别为0.5、1、2 kg/L（即每毫升含生药 0.5、1、2 g），2～8 ℃条件下保存备用。

1.1.2.2 西药配置 戊酸雌二醇按l mg/人/d，根据小鼠与人的体表面积进行换算，用三蒸水溶解药片，制成溶液，保证每毫升溶液含戊酸雌二醇0.009 mg。

1.1.2.3 试剂 超敏雌二醇放免试剂盒（北京北方生物技术研究所20080720雌二醇化学发光试剂盒）、卵泡刺激素放免试剂盒（北京北方生物技术研究所20070520 FSH放射免疫试剂盒）、促黄体生成激素放免试剂盒（北京北方生物技术研究所20070520FSH放射免疫试剂盒）。弗氏完全佐剂（CFA）和弗氏不完全佐剂（IFA）购自美国Sigma公司。

1.2 实验方法

1.2.1 造模方法 制作免疫性小鼠卵巢早衰模型：实验试剂根据小鼠透明带3（ZP3）的第330～342个氨基酸序列（NSSSSQFQIHGPR），合成透明带多肽，其分析纯度＞90%。每鼠按0.1 mL免疫试剂（ZP3＋CFA）注射后双脚掌处皮下，14 d后以新配制的免疫强化试剂 0.1 mL（ZP3＋IFA）再次注射小鼠双后脚掌处皮下加强免疫。空白对照组注射三蒸水0.1 mL。

1.2.2 分组及给药方法 小鼠常规喂养标准颗粒饲料，采用随机数字表将60只小鼠分为中药高剂量组；中药中剂量组；中药低剂量组；西药组；模型组；空白组。造模成功后第6天开始各药物组灌胃给药，乌萸汤高中低剂量组浓度分别为0.5、1、2 kg/L，每只小鼠每次灌胃量为0.02mL/g。西药组给予戊酸雌二醇按0.009g/L，每只小鼠每次灌胃量为0.02mL/g。模型组及空白组灌胃同量的0.5%的CMC，连续灌胃4周后摘眼球取血，处死小鼠，取组织待测。

1.3 检测指标

1.3.1 卵巢形态学变化 肉眼观察:造模后卵巢体积明显较空白组缩小，且形态细长，模型组更可见部分卵巢组织与周围组织粘连。光学显微镜观察:造模后与空白组比较可见发育中的卵泡及成熟的卵泡数目明显减少，依序为：西药组-大剂量-中剂量-小剂量-模型组，颗粒细胞排列紊乱，且卵巢间质可见淋巴细胞浸润，严重程度依序为：模型组-小剂量-中剂量大剂量-西药组，部分透明带缩小或增厚，形态不规整，甚至断裂，周围颗粒细胞排列紊乱无序。卵母细胞形态畸形，缩小或消失，畸形程度由重至轻依序为：模型组-小剂量-中剂量-大剂量-西药组。见图1。

1.3.2 血清促卵泡生成素（FSH）、促黄体生成素（LH）及雌二醇（E2）的检测 小鼠摘除眼球后采血，离心，取血清。按试剂盒说明书操作要求，采用放免法测定FSH、LH及E2的含量。

1.4 统计学方法 采用SPSS 13.0软件包，计量资料选用ANOVA方差分析、方差齐性检验等方法进行统计学分析并进行多重比较，P＜0.05代表有显著性差异。

2 结果

补肾疏肝法对免疫性卵巢早衰小鼠的FSH、LH、E2含量的影响见表1。灌胃4周后，通过ANOVA方法分析，模型组的FSH、LH、E2均与各组有显著性差异（P<0.05）。西药组E2与中药高剂量组有显著性差异（P<0.05）。中药低剂量组的FSH、E2与西药组有显著性差异（P<0.05）；与中药高剂量组有显著性差异（P<0.05）。中药中剂量组的FSH、E2与西药组有显著性差异（P<0.05）；与中药高剂量组有显著性差异（P<0.05）。中药高剂量组的E2与西药组有显著性差异（P<0.05）。

表1 免疫性卵巢早衰小鼠的FSH、LH、E2含量(±s)Tab.1 Comparison of FSH,LH and E2in the rats with autoimmune premature ovarian failure(±s)

表1 免疫性卵巢早衰小鼠的FSH、LH、E2含量(±s)Tab.1 Comparison of FSH,LH and E2in the rats with autoimmune premature ovarian failure(±s)

注：与模型组比较，▲P<0.05；与西药组比较，★P<0.05；中药高剂量组比较，●P<0.05。

组别空白组模型组西药组中药低剂量中药中剂量中药高剂量n 101010101010 FSH(IU/L)0.392±0.150▲0.914±0.277★●0.420±0.189▲0.501±0.232▲★0.488±0.162▲★0.403±0.203▲LH(IU/L)2.956±0.310▲4.613±0.263★●3.242±0.321▲3.302±0.443▲3.086±0.458▲2.622±0.374▲E2(ng/L)21.055±2.060▲●9.125±1.216★●19.812±1.743▲●10.876±1.907★●11.300±1.081★●14.848±0.068▲★

图1 补肾调肝法治疗后的自身免疫性卵巢早衰小鼠的病理切片Fig.1 The pathological section of rats with autoimmune premature ovarian failure after treatment of invigorating kidney and regulating liver

3 讨论

实验采用CFA+ZP31∶1混合液于小鼠双后脚掌处及皮下多处注射，建立自身免疫性卵巢早衰小鼠模型。旨在观察中药对高、中、低剂量组针对自身免疫性卵巢早衰小鼠的治疗作用及其与西药组、模型组之间的差异性。

从生殖内分泌指标来看：模型组的FSH、LH、E2均与各组有显著性差异（P<0.05）。提示造模成功。西药组E2与中药低、中、高剂量组有显著性差异（P<0.05）。表示西药在提升E2水平较中药高剂量显著。中药低剂量组与中剂量组的FSH、E2均与西药组有显著性差异（P<0.05），提示中药低剂量组与中剂量组在降低FSH升高、E2的疗效不及西药；但中药低剂量、中药中剂量组在与中药高剂量组在升高E2血清水平上有显著性差异（P<0.05），提示中药高剂量疗效优于小剂量及中剂量。中药高剂量组的FSH、LH血清水平与西药组无统计学意义（P＞0.05）。

在灌胃4周后，中药高剂量组的FSH、LH血清水平与西药组无统计学意义，但E2水平升高幅度不及西药，两者有统计学意义（P<0.05）。提示中药高剂量组与西药组比较，提升E2水平虽不及西药起效快，但中药大剂量组能恢复部分卵巢功能，且因中药不良反应小，经长期服用效果有可能优于西药组，仍可说明其意义及可行性。进而可得知补肾调肝法对卵巢早衰小鼠具有一定的治疗作用，其通过对神经-内分泌系统的调节，从而促进下丘脑-垂体-卵巢功能的恢复。

如何早期预防POF的发生及恢复卵巢功能，提高生活质量，是国内外生殖内分泌学者亟待解决的问题。目前，激素类药物是一种治疗选择，但长期应用不良反应较大，且不易为所有POF患者所接受。而中医药通过多环节发挥整体调节作用，进而改善患者症状，且不良反应较小。因此，中医药治疗POF将是极有发展前景的领域之一。近年来中医药在治疗卵巢早衰的临床研究比较活跃。本实验旨在探讨中医药在防治卵巢早衰时的思路和方法，以期给临床治疗提供强有力的依据。

[1] Gonway GS Premature ovarian failure[J].Br Med Bull,2000,3(12):643-646.

[2] 付 莉,赵怡璇.卵巢早衰实验动物模型的建立[J].生殖医学杂志,2006,15(3):179-183.