光对胆红素稳定性的影响及其在桂蒲肾清片中的含量测定

张东方，周美环，袁长季

（1.中国医科大学药学院生药教研室，沈阳 110001；2.沈阳东北大药房连锁店，沈阳 110023）

在含人工牛黄、牛黄的制剂中，含量测定项常以胆红素为指标性成分。桂蒲肾清片由人工牛黄、蒲公英、三七、鸡内金和肉桂等12味中药组成，在桂蒲肾清片的含量测定中，发现胆红素对光稳定性较差，为此，考察了光照对胆红素稳定性的影响。同时，并对含量测定方法学进行了考察。

1 仪器、试药及溶液制备

1）仪器：Waters2695型高效液相色谱议；色谱柱：迪马Diamonsil（150 mm×4.6 mm）色谱柱。2）试药：胆红素为中国药品生物制品检定所提供，批号：100077-200503。3）试剂：甲醇、四氢呋喃为色谱纯，水为重蒸水，其他试剂为分析纯。4）色谱条件：色谱柱：（1）十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（150 mm×4.6 mm）。（2）柱温25℃。（3）流动相：甲醇-四氢呋喃-0.5%醋酸溶液（80∶10∶10）；流速 1.0 mL/min；检测波长450 nm。5）对照品溶液的制备 精密称取胆红素对照品适量，置棕色量瓶中，加三氯甲烷制成每毫升含29.04 μg的溶液（避光），即得。6）供试品溶液的制备 取本品，研细，取约2 g，精密称定，精密加入三氯甲烷25 mL，称定质量，超声处理15 min，放冷，再称定质量，用三氯甲烷补足减失的质量，摇匀，滤过，取滤液（避光），即得。

2 实验方法

2.1 胆红素稳定性考察

2.1.1 稳定性实验 取供试品（批号050501），分别在 0、0.5、1、1.5、2、3、4 h 进样，结果见表 1 及图 1。结果表明，胆红素峰面积下降趋势非常明显，稳定性较差。

表1 稳定性实验结果Tab.1 Results of stability test for cholerythrin

2.1.2 胆红素的紫外光谱测试 取胆红素对照品溶液，分别在对照品溶液配制后（a）、避光放置3 h后（b）及在日光下放置3h后（c），测试紫外光谱，见图2。从光谱图可以看出，b与a略有变化，而c与a变化明显，最大吸收峰有明显紫移，紫外光谱图与胆红素光谱有明显差别。另外，从溶液外观可以看出，胆红素溶液从黄色变为绿色。

2.1.3 高效液相色谱（HPLC）法测试 分别取“2.1.2”项下3种溶液，注入液相色谱仪，测定，见图3。从液相色谱图可看出，避光放置3 h的色谱峰面积有所下降，而日光下放置3 h后，未检出胆红素色谱峰。

图2 胆红素紫外光谱图Fig.2 The UV Spectrum of cholerythrin

2.2 桂蒲肾清片中胆红素的测定

2.2.1 阴性液干扰实验 精密吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性液各10 μL，注入液相色谱议中，绘制液相色谱图 3（1、2、3）。由色谱图可知，在与对照品色谱峰相应的位置上，供试品溶液具有相同保留时间的色谱峰，阴性液在此保留时间处无色谱峰，对本品的含量测定无干扰。

2.2.2 线性范围考察 精密吸取浓度为27.16 mg/L的胆红素对照品溶液 1、4、7、10、13 μL，注入液相色谱议，测定。以进样量为横坐标，以色谱峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，线性回归，得回归方程为：Y=5042118X-11135，r=0.9997，由此可见，胆红素在0.02716～0.35308 μg范围内线性关系良好。

2.2.3 精密度实验 取同一供试品溶液（批号050501）按前文方法操作，连续进样6次，测定，峰面积的相对平均标准差（RSD）为1.2%。

2.2.4 重复性实验 取同一批号样品（050501）6份，分别按前文方法测定，计算，含量的RSD为2.0%。

2.2.5 回收率实验 精密称取6份已知含量的同一批号（批号：050501）的样品1 g，分别精密加入胆红素对照品溶液（6.79 mg/L）25 mL，按前文方法操作，测定，计算回收率，平均回收率为96.0%，RSD%为0.8%。

3 结论与讨论

1）胆红素的峰面积积分值在0.5 h测定时，已下降1.6%。供试品溶液制备好后应立即测定。

2）胆红素是一种四吡咯类化合物，是血红素的最终分解产物，光照对胆红素的影响非常大，尤其是400～500 nm波长的蓝光或绿光照射后，内侧氢键断开，其1个或2个吡咯环旋转180°，形成3种E构型的异构体，还可形成不可逆的环形化合物[1]。因此，胆红素溶液制备过程中，应特别注意避光。另外，含有胆红素的中药材及中药制剂也应避光保存。

3）胆红素是亲脂性较强的化合物，可溶于三氯甲烷，不易溶于甲醇，几乎不溶于水。因此，在对照品溶液、供试品溶液制备时，一般可采用三氯甲烷溶剂。另外，采用自动进样器进样，常用甲醇、甲醇-水作为洗针溶剂，而甲醇、甲醇-水与三氯甲烷不混溶，由于进样不完全而使测定不准确，因此，洗针溶剂可改用三氯甲烷。

[1] 姚光弼，胆红素代谢[J].肝脏，2004，9（3）：44-46.