17β-雌二醇对血管性痴呆大鼠海马CA1区神经突触可塑性的影响

孙玉华 贺维亚

河南大学淮河医院神经内科 开封 475000

近年来研究证实,雌激素对中枢神经系统损伤后有保护作用,并能改善记忆和认知功能[1],但其作用机制尚不十分清楚。为此,我们通过免疫组化、RT-PCR方法,观察雌二醇对VD大鼠海马CA1区MAP-2蛋白含量和MAP-2mRNA,SYN蛋白含量和SYNmRNA表达的变化,探讨雌二醇在调节VD大鼠神经突触可塑性中的作用。

1 材料与方法

1.1动物与分组动物均选用＞16月龄的健康Wister大鼠60只,体质量450～550 g,由河南省实验动物中心提供。以Y型电迷宫法筛选记忆良好的大鼠60只[2],随机分成假手术组、模型组、治疗组。治疗组于术后第2天起予以腹腔注射17β-雌二醇(花生油溶解500 μ g/mL),假手术组和模型组给予等量消毒花生油。连续给药30次,隔天1次,共60 d。

1.2试剂17β-雌二醇(美国Sigma公司);SP免疫组化染色试剂盒、兔抗M AP-2多克隆抗体、兔抗SYN多克隆抗体(均购自北京中山生物技术有限公司)。

1.3动物模型的建立根据Olsson方法[3],术前12 h禁食、6 h禁水。10%水合氯醛(0.30 mL/100 g)腹腔注射麻醉,沿腹侧颈正中切开,气管旁分离出双侧颈总动脉,以“0”号线双重结扎颈总动脉。假手术组动物行颈前切开,分离但不结扎颈总动脉。

1.4观察指标

1.4.1 MAP-2和SYN免疫组织化学染色过程:石蜡切片常规制备过程。

1.4.2 半定量RT-PCR测定MAP-2和SYN蛋白mRNA:①PCR引物序列及扩增片断长度依照己知的合成:M AP-2,SYNcDNA序列,由上海捷倍思基因技术有限公司设计。βactin上游5'CCTCTATGCCAACACAGTGC3'下游5'GTACT CCTGCT TGCTGATCC3'扩增长度长度为211bp,MAP-2上游 5'AGCACACGAAGCAGGGTACA3'下游5'GCAATAGAATCAAGGCAAGAC 3'扩增长度长度为259bpSYN上游5'C ACGGACCCAGAGA ACATTA 3'下游5'GGACT TCACTGACCAGAT TAC 3'扩增长度长度为447bp。②组织总RNA的抽提严格按试剂盒操作说明书进行。③RNA电泳鉴定总RNA完整性,测定总 RNA纯度、浓度,RT-PCR反应。

1.5统计学处理数据以均数士标准差(s)表示,然后运用SPSS 11.5统计软件进行单因素方差分析(One-way ANOVA),多个样本均数的两两比较用q检验法。取α=0.05作为检验水准。

2 结果

2.1 MAP-2和SYN免疫组织化学染色结果Sham组MAP-2及SYN阳性产物呈黄褐色,主要位于神经元胞体中,呈纤维条索状,连续;VD组在术后 60 d时,海马CA1区阳性产物脱失加重,连续性破坏,部分几乎全部脱失,仅见粗大、深染颗粒。E组海马CA1区阳性产物脱失明显减轻。术后各组海马神经元MAP-2及SYN表达水平的比较显示,VD组和E组M AP-2阳性产物光透过值(OD)均高于Sham组(P＜0.05),VD组的MAP-2阳性产物光透过值(OD)均显著高于E组(P＜0.05),见表1。

表1 海马CA1区MAP-2和SYN的OD值比较

表2 海马 CA1区MAP-2 M RNA和SYN mRNA相对表达率

2.2 MAP-2 mRNA和SYN mRNA半定量RT-PCR结果与Sham组比较,VD组和E组海马神经元MAP-2mRNA及SYNmRNA相对表达量显著减少P＜0.05):且VD组少于E组(P＜0.05)。见表2。

3 讨论

MAP-2是神经元的一种骨架蛋白,主要存在于神经元的树突中。Li等[4]发现,局灶性脑缺血再灌注6 h,在缺血中心区即有MAP-2的蛋白表达的增高,本研究发现VD组和E组MAP-2的mRNA和蛋白的表达在术后均降低,提示2-VO术后均有神经元的进一步损害。术后60 d雌二醇组MAP-2mRNA和蛋白的表达均高于VD组(P＜0.05),提示雌二醇治疗可以增加VD大鼠海马MAP-2的表达。说明雌二醇可能在2-VO术后促进海马神经元发出新突起。

而突触素(SYN)是突触囊泡的一种钙结合蛋白,参于神经递质的释放,突触的形成是突触功能的生化物质基础。因此,在许多神经结构重建研究中,SYN被用作神经末梢的定量指标[5-6]。本研究发现:术后60 d雌二醇组SYNmRNA和蛋白的表达均高于 VDO Perrella和Bhavnani[7]发现 17β-雌二醇可以减少神经细胞的死亡。在新生啮齿动物海马区大脑皮质或下丘脑获得的分散细胞中加入雌激素,能导致神经树突生长,突触增多[8]。本研究提示,雌二醇治疗可以增加VD大鼠海马SYN的表达,减轻突触受损,促进突触重建,这些研究为雌激素应用于临床治疗VD提供理论依据。

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